(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
【公報種別】再公表特許(A1)
(11)【国際公開番号】WO2013099043
(43)【国際公開日】20130704
【発行日】20150430
(54)【発明の名称】ヒト心筋由来トロポニンIに特異的にかつ速やかに結合できる組み換えタンパク質
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/09 20060101AFI20150403BHJP
   C07K 16/18 20060101ALI20150403BHJP
   G01N 33/53 20060101ALI20150403BHJP
   C12P 21/08 20060101ALN20150403BHJP
【FI】
   !C12N15/00 AZNA
   !C07K16/18
   !G01N33/53 D
   !C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】22
【出願番号】2013532395
(21)【国際出願番号】JP2012002464
(22)【国際出願日】20120409
(31)【優先権主張番号】2011283210
(32)【優先日】20111226
(33)【優先権主張国】JP
(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN
(71)【出願人】
【識別番号】592031097
【氏名又は名称】パナソニックヘルスケア株式会社
【住所又は居所】愛媛県東温市南方2131番地1
(74)【代理人】
【識別番号】100100158
【弁理士】
【氏名又は名称】鮫島 睦
(74)【代理人】
【識別番号】100081422
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(72)【発明者】
【氏名】福永 淳
【住所又は居所】愛媛県東温市南方2131番地1 パナソニックヘルスケア株式会社内
【テーマコード(参考)】
4B024
4B064
4H045
【Fターム(参考)】
4B024AA01
4B024BA53
4B024CA04
4B024DA06
4B024EA04
4B024FA02
4B024GA11
4B024HA03
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4H045AA11
4H045AA30
4H045AA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ヒト心筋由来トロポニンIに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供する。本発明は、ヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合する組み換えタンパク質であって、以下を具備する:配列番号:63によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および配列番号:65によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む、ヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合する組み換えタンパク質:
配列番号:63によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号:65によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。
【請求項2】
前記組み換えタンパク質が抗体である、請求項1の組み換えタンパク質。
【請求項3】
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントである、請求項1の組み換えタンパク質。
【請求項4】
前記抗体フラグメントがFab抗体フラグメントである、請求項3の組み換えタンパク質。
【請求項5】
前記抗体フラグメントがF(ab’)抗体フラグメントである、請求項3の組み換えタンパク質。
【請求項6】
前記抗体フラグメントがscFv抗体フラグメントである、請求項3の組み換えタンパク質。
【請求項7】
以下の工程を含む、組み換えタンパク質をヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合させる方法:

前記組み換えタンパク質を用意する工程(a)、ここで
前記組み換えタンパク質は以下を含む:
配列番号:63によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号:65によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、

前記組み換えタンパク質に前記ヒト心筋由来のトロポニンIを接触させ、前記組み換えタンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合させる工程(b)。
【請求項8】
前記組み換えタンパク質が抗体である、請求項7の方法。
【請求項9】
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントである、請求項7の方法。
【請求項10】
前記抗体フラグメントがFab抗体フラグメントである、請求項9の方法。
【請求項11】
前記抗体フラグメントがF(ab’)抗体フラグメントである、請求項9の方法。
【請求項12】
前記抗体フラグメントがscFv抗体フラグメントである、請求項9の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト心筋由来トロポニンIに特異的にかつ速やかに結合できる組み換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
非特許文献1および非特許文献2は、心筋由来トロポニンIの濃度が、急性心筋梗塞に罹患した患者の血液中で急速に高くなることを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Aleksei G. Katrukha et. al., ”Troponin I is released in bloodstream of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex”, Clinical Chemistry, Vol. 43, Issue 8, p.p. 1379-1385 (1997)
【非特許文献2】Till Keller et. al.,.”Sensitive Troponin I Assay in Early Diagnosis of Acute Myocardinal Infarction”, The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE, Vol. 361, pages 868-877 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、ヒト心筋由来トロポニンIに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、ヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合する組み換えタンパク質であって、以下を具備する:
配列番号:63によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号:65によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域。

前記組み換えタンパク質が抗体であり得る。
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがFab抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがF(ab’)抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがscFv抗体フラグメントであり得る。

本発明は、組み換えタンパク質をヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合させる方法であって、以下の工程を具備する:
前記組み換えタンパク質を用意する工程(a)、ここで
前記組み換えタンパク質は以下を具備する:
配列番号:63によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、および
配列番号:65によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、

前記組み換えタンパク質に前記ヒト心筋由来のトロポニンIを接触させ、前記組み換えタンパク質を前記ヒト心筋由来のトロポニンIに特異的に結合させる工程(b)。
好ましくは、前記方法において、工程(b)は、インビトロで行う。

前記組み換えタンパク質が抗体であり得る。
前記組み換えタンパク質が抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがFab抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがF(ab’)抗体フラグメントであり得る。
前記抗体フラグメントがscFv抗体フラグメントであり得る。
【発明の効果】
【0006】
本発明は、ヒト心筋由来トロポニンIに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供する。
本発明の組み換えタンパク質および方法は、急性心筋梗塞の早期検出に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図1は抗体を示す。
【図2】図2は、工程(c−2)におけるPCR法を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、本発明の実施形態が説明される。
【0009】
(用語の説明)
まず、本明細書において用いられる用語が説明される。
図1は、抗体を示す。広く知られているように、抗体1は「Y」文字の形状を有する。抗体1は2つのFab領域および1つのFc領域からなる。抗体1は、2本の重鎖2および2本の軽鎖3からなる。各重鎖2は、重鎖定常領域1(参照符号:22)、重鎖定常領域2(参照符号:23)、重鎖定常領域3(参照符号:24)、および重鎖可変領域21からなる。各軽鎖3は、軽鎖可変領域31および軽鎖定常領域32からなる。
【0010】
各Fab領域は、1つの重鎖可変領域21、1つの重鎖定常領域1(参照符号:22)、1つの軽鎖可変領域31、および1つの軽鎖定常領域32からなる。軽鎖3はリンカ4により重鎖2に連結されている。重鎖2は先端に1つの重鎖可変領域21を有している。軽鎖3は先端に1つの軽鎖可変領域31を有している。抗体1には抗原が特異的に結合する。より詳細には、抗原は重鎖可変領域21および軽鎖可変領域31からなるFv領域に特異的に結合する。本明細書においては、抗原はヒト心筋由来のトロポニンIである。
【0011】
本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号:63によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域31および配列番号:65によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域21を具備する。本組み換えタンパク質は、ヒト心筋由来のトロポニンIに特異的にかつ速やかに結合する。
【0012】
本組み換えタンパク質は、抗体または抗体フラグメントのいずれかである。
【0013】
抗体は、図1に示される「Y」文字状の形状を有する。本発明の抗体に含まれる軽鎖可変領域31および重鎖可変領域21は、それぞれ、配列番号63および配列番号65によって表されるアミノ酸配列からなる。抗体において、軽鎖可変領域31は重鎖可変領域21にリンカ(図示せず)を介して連結している。
【0014】
抗体フラグメントの例は、Fab抗体フラグメント、F(ab’)抗体フラグメント、またはscFv抗体フラグメントである。
【0015】
Fab抗体フラグメントは、1つのFab領域からなる。言い換えれば、Fab抗体フラグメントは、1つの軽鎖可変領域31(配列番号:63)、1つの重鎖可変領域21(配列番号:65)、1つの軽鎖定常領域32、1つの重鎖定常領域1(参照符号:22)、およびリンカ4からなる。軽鎖定常領域32は、リンカ4を介して重鎖定常領域1(参照番号:22)に連結している。
【0016】
F(ab’)抗体フラグメントは、2つのFab領域からなる。上記の通り、各Fab領域は、1つの軽鎖可変領域31(配列番号:63)、1つの重鎖可変領域21(配列番号:65)、1つの軽鎖定常領域32、1つの重鎖定常領域1(参照符号:22)、およびリンカ4からなる。これらの2つのFab領域は、他のリンカ(図示せず)を介して互いに連結されている。好ましくは、一方の重鎖定常領域1(参照番号:22)が、他のリンカ(図示せず)を介して他方の重鎖定常領域1(参照番号:22)に連結している。
【0017】
scFv抗体フラグメントは、軽鎖可変領域31(配列番号:63)、重鎖可変領域21(配列番号:65)、およびリンカからなる。軽鎖可変領域31(配列番号:63)は、リンカ(図示せず)を介して重鎖可変領域21(配列番号:65)に連結している。
【0018】
組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンIに特異的かつ速やかに結合できる限り、軽鎖可変領域31(配列番号:63)と重鎖可変領域21(配列番号:65)を連結するリンカは特に限定されない。リンカの例は5〜20のアミノ酸からなるペプチドである。より具体的には、リンカの例は、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号:64)により表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。リンカの他の例は、ジスルフィド結合(−硫黄原子(S)−硫黄原子(S)−)である。
【0019】
組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンIに特異的かつ速やかに結合できる限り、軽鎖可変領域31(配列番号:63)のN末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。C末端もまた、修飾され得る。
【0020】
組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンIに特異的かつ速やかに結合できる限り、重鎖可変領域21(配列番号:65)のN末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。C末端もまた、修飾され得る。重鎖可変領域21(配列番号:65)のC末端を修飾するアミノ酸配列の例は、ASVDKLAAALEHHHHHH(配列番号:66)である。
【0021】
本組み換えタンパク質はヒト心筋由来トロポニンIに接触されると、ヒト心筋由来トロポニンIに特異的にかつ速やかに結合する。より具体的には、本組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンIと混合されると、本組み換えタンパク質はヒト心筋由来トロポニンIに特異的にかつ速やかに結合する。
本組み換えタンパク質とヒト心筋由来トロポニンIとの結合の検出は、当業者に周知の抗原抗体結合の検出方法によって行うことができる。かかる検出方法の例としては、サンドウィッチ法が挙げられる。
【0022】
本組み換えタンパク質は、一般的なタンパク質発現技術を用いて産生され得る。より具体的には、まず、本組み換えタンパク質をコードする遺伝子配列を具備するベクターを用意する。ベクターの例は、プラスミドである。次に、このベクターを用いて細胞(例えば、大腸菌)が形質転換される。この細胞は培養され、本組み換えタンパク質を産生する。
【0023】
scFv抗体フラグメントを効率的に得るためには、本組み換えタンパク質は、リフォールディング法により産生されることが好ましい。非特許文献3は、リフォールディング法を開示している。
【0024】
[非特許文献3]Jun Kamishikiryo et. al., ”Molecular Basis for LLT1 Protein Recognition by Human CD161 Protein (NKRP1A/KLRB1)”, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 286, NO. 27, p.p. 23823-23830.
【実施例】
【0025】
以下、本実施形態を裏付ける実施例が説明される。
【0026】
(実施例1)
表1、表2、表3、および表4は、実施例1において用いられたプライマーを示す。
表1は、軽鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー(プライマー1〜21、配列番号:02〜配列番号:22)を示す。
表2は、重鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー(プライマー22〜44、配列番号:23〜配列番号:45)を示す。
表3は、軽鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー(プライマー45〜49、配列番号:46〜配列番号:50)を示す。
表4は、重鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー(プライマー50〜55、配列番号:51〜配列番号:56)を示す。
【0027】
【表1】
【0028】
【表2-1】
【表2-2】
【0029】
【表3】
【0030】
【表4】
【0031】
工程(a−1) ヒト心筋由来トロポニンIに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマ(マウス脾臓由来)の調製
ヒト心筋由来のトロポニンIに含有されるアミノ酸配列を有するペプチド(配列番号:01、シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入、QPLELAGLGFAELQDL)が、sulfo-SMCCクロスリンカー(サーボフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入)を用いて、ヒト血清アルブミン(シグマ・アルドリッチから購入)に連結された。
【0032】
より具体的には、sulfo-SMCCクロスリンカー(0.5mg)が、100マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第1水溶液を得た。この第1水溶液は、50℃の温度下で10分、放置された。
【0033】
ヒト血清アルブミン(10mg)が1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水に溶解され、第2水溶液を得た。
【0034】
第1水溶液は第2水溶液と混合され、混合物を得た。混合物は、30分間、静置された。このようにして、sulfo-SMCCクロスリンカーがヒト血清アルブミンに結合された。
【0035】
混合物は、カラム(GEヘルスケアより商品名:PD10として入手)に通され、未反応のsulfo-SMCCクロスリンカーを除去した。
【0036】
上記ペプチド(配列番号:01、1.5mg)がジメチルスルホキシド(以下、DMSOという)により溶解され、DMSO溶液を得た。2mg/mlの濃度を有する混合物(1mL)にDMSO溶液(100マイクロリットル)が添加された。その後、一晩、混合物は放置され、sulfo-SMCCクロスリンカーがペプチド(配列番号:01)に結合された。
【0037】
このようにして、トロポニンIに含まれるアミノ酸配列を有するペプチド(配列番号:01)により修飾されたヒト血清アルブミンが得られた。以下、このヒト血清アルブミンは「トロポニン修飾HSA」という。
【0038】
完全フロイトアジュバント(和光純薬工業株式会社から購入)およびトロポニン修飾HSAが混合され、混合物を得た。この混合物をBALB/cマウスに注入した。BALB/cマウスとは、アルビノマウスの一種である。
【0039】
2週間後、リン酸緩衝生理食塩水(以下、「PBS」という)およびトロポニン修飾HSAの混合物がBALB/cマウスに注入された。これをもう一度繰り返した。このようにして、1ヶ月かけて、BALB/cマウスはトロポニン修飾HSAにより免疫された。言い換えれば、上記混合物をBALB/Cマウスに与えることによって、BALB/cマウスの体内において、トロポニン修飾HSAに対する抗体が産生された。
【0040】
免疫されたBALB/cマウスの脾臓が摘出された。非特許文献4に記載された細胞融合法に従って、ハイブリドーマを得た。その後、ハイブリドーマは培養液中で培養された。培養の後のハイブリドーマ(細胞)の数は、およそ5×10であった。このようにして得られたハイブリドーマは、ヒト心筋由来トロポニンIに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能であった。
【0041】
[非特許文献4]
G.Kohler et al., Nature, 256, 495(1975)
【0042】
工程(a−2) ハイブリドーマ細胞からの全マウスRNAの抽出
培養されたハイブリドーマの細胞膜を破壊するために、1mLのTRIzol(インビトロジェン株式会社より入手)が、ハイブリドーマを含有する培養液に添加され、そして充分に培養液は攪拌された。
【0043】
次に、0.2mLの体積を有するクロロホルム液(純度:99.9%)が培養液に添加され、そして再度、充分に培養液は攪拌された。
【0044】
培養液は、117600m/sの重力加速度で、4℃の温度下、15分間、遠心分離に供された。上清(500μL)が取得された。得られた上清にイソプロパノール(500μL)を添加し、室温下で10分間、静置された。
【0045】
培養液は、再度、上記の条件と同一の条件を有する遠心分離に供され、沈殿物を得た。得られた沈殿物に75%エタノール水溶液(1mL)を添加し、エタノール溶液を得た。
【0046】
エタノール溶液は、73500m/sの重力加速度で、5分間、遠心分離に供された。沈殿物は、乾燥された。このようにして、全マウスRNAが得られた。
【0047】
工程(b−1) 全マウスRNAからのmRNAの抽出
OligotexTM−dT30<Super>mRNA Purification kit (タカラバイオ株式会社から購入)を用いて、工程(a−2)において得られた全マウスRNAからmRNAが抽出された。
【0048】
RNaseフリーの水(100μL)が1本のマイクロチューブに注入された。このマイクロチューブは、ブロックインキュベーター(アステック株式会社より入手)にセットされ、1時間、70℃に加温された。
【0049】
全マウスRNAが、RNaseフリーの水(100μL)に溶解された。
【0050】
キットに含まれている2×バインディング緩衝液(100μL)およびキットに含まれているオリゴテックス(10μL)がRNaseフリーの水(100μL)に混合された。その後、混合物は70℃の温度下で3分間、静置された。さらに室温で10分間、混合物は静置された。
【0051】
混合物は、147000m/sの重力加速度で、5分間、遠心分離に供された。上清が除去され、キットに含まれているウォッシュ緩衝液(350μL)に沈殿物が懸濁された。懸濁液は、キットに含まれているカラムに供給された。カラムは、147000m/sの重力加速度で、30秒間、遠心分離に供された。
【0052】
カラムを洗浄するために、カラムにウォッシュ緩衝液(350μL)が供給された。再度、カラムは、147000m/sの重力加速度で、30秒間、遠心分離に供された。
【0053】
カラムの底部にサンプル採取用のマイクロチューブが装着された。
【0054】
カラムに含有されているmRNAを抽出するために、マイクロチューブに含有されているRNaseフリーの水(20μL)がカラムに供給された。その後、カラムは、147000m/sの重力加速度で、3分間、遠心分離に供された。再度、RNaseフリーの水(20μL)がカラムに供給され、カラムは、147000m/sの重力加速度で、3分間、遠心分離に供された。
【0055】
このようにして、mRNAを含有する抽出液がマイクロチューブ内に得られた。
【0056】
工程(b−2) mRNAからcDNAへの逆転写
得られた抽出液に含まれるmRNAが、逆転写酵素(商品名:Primersript、タカラバイオ株式会社から購入)を用いて逆転写され、cDNAを含む溶液を得た。
【0057】
工程(b−3−1) cDNAを用いた、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるcDNA、フォワードプライマー1〜21(配列番号:02〜22)、およびリバースプライマー1〜5(配列番号:23〜27)を用いるPCR法により、上記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片(配列番号:58、以下、「VL遺伝子断片」という)が増幅された。このPCR法において用いられるポリメラーゼは、商品名:TaKaRa Ex Taq Hot start Versionとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
【0058】
このPCR法のプロトコールは表5の通り。
【表5】
サイクル回数:35回。
【0059】
最後に溶液は68℃で4分間放置された。このようにして、PCR溶液が得られた。このPCR溶液は、増幅されたVL遺伝子断片(配列番号:58)を含有していた。
【0060】
増幅されたVL遺伝子断片の確認および精製のために、得られたPCR溶液は、2重量%の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
【0061】
工程(b−3−2) cDNAを用いた、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるcDNA、フォワードプライマー22〜44(配列番号:28〜50)、およびリバースプライマー6〜11(配列番号:51〜56)を用いるPCR法により、上記モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片(配列番号:57、以下、「VH遺伝子断片」という)が増幅された。このPCR法において用いられるポリメラーゼは、商品名:TaKaRa Ex Taq Hot start Versionとしてタカラバイオ株式会社から購入された。
【0062】
このPCR法のプロトコールは、VL遺伝子断片のプロトコールと同一であった。
【0063】
最後に溶液は68℃で4分間放置された。このようにして、PCR溶液が得られた。このPCR溶液は、増幅されたVH遺伝子断片(配列番号:57)を含有していた。
【0064】
VH遺伝子断片の生成の確認およびVH遺伝子断片の精製のために、得られたPCR溶液は、2重量%の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
【0065】
工程(b−4) VL遺伝子断片およびVH遺伝子断片の連結
精製されたVH遺伝子断片(配列番号:57)は、精製されたVL遺伝子断片(配列番号:58)にオーバーラップエクステンションPCR法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のscFv抗体フラグメントをコードする遺伝子断片(配列番号:59、以下、「scFv遺伝子断片」という)を得た。得られた遺伝子断片(配列番号:59)の5’末端および3’末端は、制限酵素サイトNco1およびNot1によってそれぞれ修飾されていた。
【0066】
工程(c−1) 遺伝子のベクターへの導入
scFv遺伝子断片は、タンパク質発現用ベクター(商品名:pET22b(+)、タカラバイオ株式会社より購入)にライゲーションされた。ライゲーションの詳細は以下に記述される。
【0067】
最初に、scFv遺伝子断片は、制限酵素Nco1およびNot1(いずれもタカラバイオ株式会社より購入)によって処理された。scFv遺伝子断片は、電気泳動法により精製され、scFv遺伝子断片を含有する水溶液を得た。
【0068】
タンパク質発現用ベクターもまた、制限酵素Nco1およびNot1(いずれもタカラバイオ株式会社より購入)によって処理された。タンパク質発現用ベクターも、電気泳動により精製され、タンパク質発現用ベクターを含有する水溶液を得た。
【0069】
これら2つの水溶液が混合され、混合液を得た。
【0070】
混合液に、酵素(東洋紡株式会社より商品名:Ligation High ver.2として購入)が添加され、そして混合液は16℃の温度下で2時間放置された。このようにして、scFv遺伝子断片がタンパク質発現用ベクターにライゲーションされた。
【0071】
このようにしてscFv遺伝子断片がライゲーションされたタンパク質発現用ベクターを用いて、大腸菌(商品名:DH5αコンピテントセル、タカラバイオ株式会社より入手)が形質転換された。
【0072】
その後、大腸菌は、100μg/mLの濃度を有するアンピシリンを含有するLBプレート培地上で16時間、インキュベートされた。インキュベートの後、LBプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、100μg/mLの濃度を有するアンピシリンを含有するLB液体培地(5mL)に供給され、そして16時間インキュベートされた。
【0073】
タンパク質発現ベクターpET22b(+)に含まれる不要な遺伝子配列を除去するために、このLB液体培地からタンパク質発現ベクターpET22b(+)がキット(株式会社キアゲンより商品名:QIAprep spin miniprep kitとして入手)を用いて抽出された。抽出されたタンパク質発現ベクターpET22b(+)、プライマー56(配列番号:67)、およびプライマー57(配列番号:68)を用いたPCR法により、タンパク質発現ベクターpET22b(+)のシグナル配列(DNA配列、配列番号:60)が除去された。このようにして、野生型scFv抗体フラグメントをコードする発現ベクターを得た。
【0074】
工程(c−2) ベクターへの変異の導入
工程(c−1)において得られた発現ベクターは、scFv遺伝子断片(配列番号:59)を含む。この発現ベクターに含まれるscFv遺伝子断片(配列番号:59)からなる747塩基のうち、8個の塩基が置換された。より詳細には、593番目のシトシン(C)、594番目のシトシン(C)、604番目のグアニン(G)、606番目のシトシン(C)、610番目のグアニン(G)、611番目のシトシン(C)、612番目のシトシン(C)、および618番目のシトシン(C)が、それぞれ、A(アデニン)、A(アデニン)、A(アデニン)、A(アデニン)、A(アデニン)、A(アデニン)、A(アデニン)、およびA(アデニン)に置換された。
【0075】
より具体的には、図2に示されるように、プライマー58(配列番号:69)、プライマー59(配列番号:70)、および工程(c−1)において得られた発現ベクターを用いるPCR法が実施された。プライマー58(配列番号:69)は、置換される8塩基を除き、scFv遺伝子断片(配列番号:59)に含まれる575番目の塩基から641番目の塩基までの遺伝子配列に相補的であった。プライマー59(配列番号:70)は、置換される8塩基を除き、scFv遺伝子断片(配列番号:59)に相補的な遺伝子断片に含まれる575番目の塩基から641番目の塩基までの遺伝子配列に相補的であった。図2に示されるPCR法により、野生型scFv抗体フラグメントをコードする発現ベクターに含まれる8塩基(CC、G、C、GCC、C)が、他の8塩基(AA、A、A、AAA、A)に置換された。このようにして、変異型scFvをコードする遺伝子配列(配列番号:71)を含有する発現ベクターが得られた。
【0076】
工程(c−3) ベクターを用いた蛋白質の取得
工程(c−2)において得られたベクターを用いて、大腸菌(タカラバイオ株式会社より購入、商品名:BL21(DE3))が形質転換された。その後、この大腸菌は、100μg/mLの濃度を有するアンピシリンを含有するLBプレート培地上で37℃の温度下、16時間インキュベートされた。
【0077】
インキュベートの後、LBプレート培地上に形成されたシングルコロニーがピックアップされた。シングルコロニーは、100μg/mLの濃度を有するアンピシリンを含有するLB液体培地(500mL)に供給された。その後、600ナノメートルの波長でのLB液体培地の吸光度が0.5に調整されるように、シングルコロニーに含有される大腸菌が増殖された。
【0078】
さらに、1Mの濃度を有するイソプロピルーβ−D−チオガラクトピラノシドの水溶液(0.5mL)がLB液体培地に添加された。その後、37℃の温度下で5時間、振盪しながら、大腸菌がインキュベートされた。このようにして、培養液が得られた。
【0079】
得られた培養液は、49000m/sの重力加速度、4℃の温度下、5分間、遠心分離に供された。大腸菌を含有する沈殿は、リン酸緩衝生理食塩水(50mL)に再度、懸濁された。
【0080】
懸濁液は超音波処理に供され、大腸菌を破砕した。破砕された大腸菌を含有する溶液は、98000m/sの重力加速度、4℃の温度下、30分間、遠心分離に供された。このようにして、沈殿物が得られた。
【0081】
この沈殿物は、4%の濃度を有する界面活性剤(TritonX-100、和光純薬工業株式会社より入手)を含有するリン酸緩衝生理食塩水を用いて2回、洗浄された。さらに、沈殿物は界面活性剤を含有しないリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄された。
【0082】
沈殿物に、表6に示される試薬を含有する水溶液A(10mL)が添加された。
【0083】
【表6】
【0084】
水溶液Aは6のpHを有していた。
【0085】
その後、水溶液Aは4℃の温度下で18時間放置された。このようにして、沈殿物は溶解された。
【0086】
水溶液Aは、0.45μmのメッシュサイズを有するフィルター(Sartoriusより入手、商品名:Minisart)に通され、残渣を除去した。このようにして、濾液を得た。
【0087】
濾液(1mL)に、表7に示される試薬を含有する水溶液B(2mL)が滴下により添加された。
【0088】
【表7】
【0089】
水溶液Bは8.0のpHを有していた。このようにして、3mLの容積を有する水溶液を得た。
【0090】
水溶液(3mL)は、1リットルの容積を有する水溶液Bに滴下により添加された。その後、得られた水溶液は、4℃の温度下で96時間、攪拌された。このようにして、変異体scFv抗体フラグメント(配列番号:61)が得られた。
【0091】
その後、濾過ユニット(VIVAFLOW50、Sartoriusより入手)を用いて、溶液は10mLまで濃縮された。カラム(商品名:HiLoad 26/60 Superdex 75 pg、GEヘルスケア社製)を用いて、溶液に含まれる変異体scFv抗体フラグメントが精製された。
【0092】
変異体scFv抗体フラグメントのアミノ酸配列(配列番号:61)の詳細は以下に記述される。

軽鎖可変領域(配列番号:63):
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELKR
軽鎖可変領域のN末端に修飾されたアミノ酸配列:なし
軽鎖可変領域のC末端に修飾されたアミノ酸配列:なし

リンカ(配列番号:64):
GGGGSGGGGSGGGGS

重鎖可変領域(配列番号:65):
EVKLEESGGGLVKPGGTLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLDWVATISSGGSYIFYPDSVKGRFKISRKNKRKTLYLQMNSLRSEDTAMYYCARHHNPDKSGFAYWGQGTLVTVSA
重鎖可変領域のN末端に修飾されたアミノ酸配列:なし
重鎖可変領域のC末端に修飾されたアミノ酸配列:ASVDKLAAALEHHHHHH(配列番号:66)
【0093】
工程(d) 結合速度定数および解離速度定数の算出
分子間相互作用解析装置Biacore T100(GEヘルスケア社より購入)を用いて、変異体scFv抗体フラグメントの結合速度定数および解離速度定数が、分子間相互作用解析装置Biacore T100に添付されているマニュアルに従って算出された。
【0094】
およそ500のRU(Resonance Unit)を有するヒト心筋由来トロポニンI(フナコシより購入)がCM5チップ(GEヘルスケア社より購入)上に固定された。このCM5チップはBiacore T100内にセットされた。次に、変異体scFv抗体フラグメントを含有する水溶液(濃度:100nM,50nM、25nM、12.5nM、および6.25nM、容量:150マイクロリットル)をBiacore T100内に流した。分子間相互作用解析装置Biacore T100によって測定された結合速度定数および解離速度定数は、表9に示される。
【0095】
(比較例1)
比較例1では、工程(c−2)が行われなかったこと以外は、実施例1と同様の実験が行われた。このようにして、配列番号:62によって表されるアミノ酸配列からなる野生型scFv抗体フラグメントを得た。実施例1と同様に、野生型scFv抗体フラグメントの結合速度定数(ka1,ka2)および解離速度定数(kd1,kd2)が測定された。結果は、表9に示される。
【0096】
野生型scFv抗体フラグメント(配列番号:62)および変異型scFv抗体フラグメント(配列番号:61)の間の相違点は表8に記載される。
【0097】
【表8】
【0098】
【表9】
【0099】
表9から明らかなように、実施例1による変異型scFv抗体フラグメントは、比較例1による野生型scFv抗体フラグメントよりも高い結合速度定数を有する。これは、変異型scFv抗体フラグメントは、野生型scFv抗体フラグメントよりも速やかにヒト心筋由来トロポニンIに特異的に結合することを意味する。
【産業上の利用可能性】
【0100】
本発明による方法は、急性心筋梗塞を検出するためのセンサに用いられ得る。
【符号の説明】
【0101】
1:抗体
2:重鎖
21:重鎖可変領域
3:軽鎖
31:軽鎖可変領域
4:リンカ
【図1】
【図2】
【配列表】
2013099043000001.app
【国際調査報告】