(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】2016512432
(43)【公表日】20160428
(54)【発明の名称】酢酸グラチラマー応答バイオマーカーmRNA効力アッセイ
(51)【国際特許分類】
   C12Q 1/68 20060101AFI20160401BHJP
   A61K 38/00 20060101ALI20160401BHJP
   A61P 25/00 20060101ALI20160401BHJP
   C12N 15/09 20060101ALN20160401BHJP
【FI】
   !C12Q1/68 A
   !A61K37/02
   !A61P25/00
   !C12N15/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】121
(21)【出願番号】2016501627
(86)(22)【出願日】20140312
(85)【翻訳文提出日】20151104
(86)【国際出願番号】US2014024748
(87)【国際公開番号】WO2014159685
(87)【国際公開日】20141002
(31)【優先権主張番号】61/786,108
(32)【優先日】20130314
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US
(71)【出願人】
【識別番号】508368275
【氏名又は名称】マイラン・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Mylan Inc.
【住所又は居所】アメリカ合衆国15317ペンシルベニア州キャノンズバーグ、コーポレイト・ドライブ1500番、スウィート400
(74)【代理人】
【識別番号】100081422
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄
(74)【代理人】
【識別番号】100084146
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 宏
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー・ピー・スミス
【住所又は居所】アメリカ合衆国26508ウエストバージニア州モーガンタウン、オータム・アベニュー1042番
(72)【発明者】
【氏名】ピーター・イー・リプスキー
【住所又は居所】アメリカ合衆国22901バージニア州シャーロッツビル、ロンドン・ロード1545番
【テーマコード(参考)】
4B024
4B063
4C084
【Fターム(参考)】
4B024AA11
4B024CA04
4B024CA09
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4C084AA02
4C084BA44
4C084CA59
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4C084ZA022
(57)【要約】
本発明は、酢酸グラチラマー(GA)の試験ロットまたは参照標準ロットを用いる刺激に応答してマウスT細胞中で生成されるmRNA応答バイオマーカーのレベルを定量し比較することによりGAの試験ロットの効力を決定するためのアッセイについて記載し、T細胞は、GAの試験ロットまたは参照標準ロットを用いて免疫化したマウスから得られる。本発明のアッセイにおいて有用なmRNA応答バイオマーカーを同定するための方法も記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酢酸グラチラマー(GA)の試験ロットの効力を決定するための方法であって、
試験動物を、規定量のGA参照標準ロットを用いて免疫化すること;
免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること;
所定量のGA参照標準ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの試験ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;
所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種の量を測定し、所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種の量を測定すること;および
所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種の量と、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種の量とを比較し、
それによって、GAの試験ロットの相対効力を決定すること
を含む方法。
【請求項2】
試験動物がマウスである、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
GA参照ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定され、GA試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、サイトカイン、活性化マーカーもしくはサイトカイン受容体、またはケモカインをコードする遺伝子から転写される、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、
a)IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、もしくはIL−17、IL−18、IL−21、IL−22、IFN−γ、TNF−α(TNF)、TNF−β(LT)、TGF−β、およびIL−1βからなる群から選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される;
b)CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA−DMA、HLA−DMB、IFN−γR2、IL−12RB1、IL−2RA、IL−2RG、IL−4R、IL−6R、IL−10RB、TGFBR2、FOXP3、およびHLA−DRからなる群から選択される活性化マーカーもしくはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される;または
c)IL−8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、およびCXCL7からなる群から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される、
請求項3に記載の方法。
【請求項5】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、TNF−α、CD25、またはIL1−βをコードする遺伝子から転写される、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
少なくとも2つのGA応答バイオマーカーmRNA種を測定し、少なくとも2つの測定されるGA応答バイオマーカーmRNA種の各々が、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
GAの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
所望の相対効力が、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約90%〜約125%である、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
所望の相対効力が、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約95%〜約125%である、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAをリアルタイムPCRにより測定する、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAを、インキュベーションが開始した後約4時間〜約6時間で測定する、請求項1に記載の方法。
【請求項13】
タンパク質合成阻害剤を、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する、請求項1に記載の方法。
【請求項14】
参照標準ロットがCopaxoneであるか、またはCopaxoneではないGAのロットである、請求項1に記載の方法。
【請求項15】
GAを含有する医薬組成物を調製するための方法であって、前記方法中に、GAの試験ロットを試験して、それがGA参照標準ロットの効力と比べて所望の効力を有するかどうかを決定し、前記方法が、
GAの試験ロットの効力を決定し、それを参照標準ロットの効力と比較することであって、GAの試験ロットと参照標準ロットの効力が、規定量のGA参照標準ロットを用いて免疫化した試験哺乳動物から取り出したリンパ節細胞の培養物の細胞中で生成された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種の量を測定することにより決定され、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を、所定量のGA参照標準ロットの存在下でインキュベートし、実質的に同一の所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を、同じ所定量のGAの試験ロットの存在下でインキュベートすること;および
GAの試験ロットが参照標準ロットの効力と比べて所望の効力を有すると決定された場合にのみ、GAの試験ロットを医薬組成物に混合すること
を含む方法。
【請求項16】
試験哺乳動物がマウスである、請求項15に記載の方法。
【請求項17】
GA参照ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定され、GA試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、サイトカイン、活性化マーカーもしくはサイトカイン受容体、またはケモカインをコードする遺伝子から転写される、請求項15に記載の方法。
【請求項18】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、
a)IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、もしくはIL−17、IL−18、IL−21、IL−22、IFN−γ、TNF−α(TNF)、TNF−β(LT)、TGF−β、およびIL−1βからなる群から選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される;
b)CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA−DMA、HLA−DMB、IFN−γR2、IL−12RB1、IL−2RA、IL−2RG、IL−4R、IL−6R、IL−10RB、TGFBR2、FOXP3、およびHLA−DRからなる群から選択される活性化マーカーもしくはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される;または
c)IL−8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、およびCXCL7からなる群から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される、
請求項17に記載の方法。
【請求項19】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、TNF−α、CD25、またはIL1−βをコードする遺伝子から転写される、請求項18に記載の方法。
【請求項20】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される、請求項19に記載の方法。
【請求項21】
少なくとも2つのGA応答バイオマーカーmRNA種を測定し、少なくとも2つの測定されるGA応答バイオマーカーmRNA種の各々が、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される、請求項20に記載の方法。
【請求項22】
所望の相対効力が、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約90%〜約125%である、請求項15に記載の方法。
【請求項23】
所望の相対効力が、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約95%〜約125%である、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAをリアルタイムPCRにより測定する、請求項15に記載の方法。
【請求項25】
応答バイオマーカーmRNAを、インキュベーションが開始した後約4時間〜約6時間で測定する、請求項15に記載の方法。
【請求項26】
タンパク質合成阻害剤を、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する、請求項15に記載の方法。
【請求項27】
参照標準ロットがCopaxoneであるか、またはCopaxoneではないGAのロットである、請求項15に記載の方法。
【請求項28】
GAの試験ロットの効力および交差効力を決定するための方法であって、
a)第1の試験動物を、規定量のGA参照標準ロットを用いて免疫化すること;
b)第2の試験動物を、規定量のGA試験ロットを用いて免疫化すること;
c)免疫化した第1の試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養し、免疫化した第2の試験動物から取り出したリンパ節細胞を別途培養すること;
d)所定量のGA参照標準ロットの存在下で免疫化した第1の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの試験ロットの存在下で免疫化した第1の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;
e)所定量のGA参照標準ロットの存在下で免疫化した第2の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの試験ロットの存在下で免疫化した第2の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;
f)(i)所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA、および(ii)所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中の同じ少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;
g)(i)所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA、および(ii)所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中の同じ少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;
h)所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量とを比較し、それによって、GAの試験ロットの相対効力を決定すること;
i)所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量とを比較し、それによって、GAの参照標準ロットの相対効力を決定すること;
j)所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と、所定量のGA試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量とを比較し、それによって、GAの試験ロットの交差効力を決定すること
を含む方法。
【請求項29】
第1の試験動物および第2の試験動物が、同じマウス系統のマウス:HLA適合マウス;同腹子;および双子から選択されるマウスである、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
GA参照ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で、工程(f)(i)、(f)(ii)、(g)(i)、および(g)(ii)において測定され、GA試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、サイトカイン、活性化マーカーもしくはサイトカイン受容体、またはケモカインをコードする遺伝子から転写される、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、
a)IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、もしくはIL−17、IL−18、IL−21、IL−22、IFN−γ、TNF−α(TNF)、TNF−β(LT)、TGF−β、およびIL−1βからなる群から選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される;
b)CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA−DMA、HLA−DMB、IFN−γR2、IL−12RB1、IL−2RA、IL−2RG、IL−4R、IL−6R、IL−10RB、TGFBR2、FOXP3、およびHLA−DRからなる群から選択される活性化マーカーもしくはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される;または
c)IL−8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、およびCXCL7からなる群から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される、
請求項30に記載の方法。
【請求項32】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、TNF−α、CD25、またはIL1−βをコードする遺伝子から転写される、請求項31に記載の方法。
【請求項33】
測定される少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNA種が、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される、請求項32に記載の方法。
【請求項34】
少なくとも2つのGA応答バイオマーカーmRNA種を測定し、少なくとも2つの測定されるGA応答バイオマーカーmRNA種の各々が、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
GAの試験ロットが所望の相対効力、所望の交差効力、またはその両方を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項36】
GAの試験ロットの所望の相対効力、所望の相対交差効力、またはその両方が、少なくとも約75%〜約125%である、請求項35に記載の方法。
【請求項37】
所望の相対効力もしくは所望の相対交差効力、またはその両方が、少なくとも約80%〜約120%である、請求項36に記載の方法。
【請求項38】
少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAをリアルタイムPCRにより測定する、請求項27に記載の方法。
【請求項39】
応答バイオマーカーmRNAを、インキュベーションが開始した後約4時間〜約6時間で測定する、請求項27に記載の方法。
【請求項40】
タンパク質合成阻害剤を、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する、請求項27に記載の方法。
【請求項41】
参照標準ロットがCopaxoneであるか、またはCopaxoneではないGAのロットである、請求項27に記載の方法。
【請求項42】
GAの第2のロットの効力を決定するための方法であって、
試験動物を、規定量の第1のGAロットを用いて免疫化すること;
免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること;
所定量の第1のGAロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの第2のロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;
所定量の第1のGAロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定し、所定量のGAの第2のロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;および
所定量のGAの第2のロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と、所定量の第1のGAロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量とを比較し、それによって、GAの第2のロットの相対効力を決定すること
を含む方法。
【請求項43】
第1のGAロットがCopaxone、GAの参照標準ロット、またはGAの試験ロットであり、第2のGAロットがCopaxone、GAの参照標準ロット、またはGAの試験ロットである、請求項42に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、35U.S.C.119(e)の下で、2013年3月14日に出願された米国仮特許出願第61/786,108号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
酢酸グラチラマーは、多発性硬化症を処置するために認可された合成ペプチド薬である。それは、アミノ酸L−グルタミン酸、L−アラニン、L−チロシン、およびL−リシンを含有する合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。現在、Copaxone(登録商標)として販売されている酢酸グラチラマー注射液は、最初の臨床症状を経験し多発性硬化症と一致するMRI特徴を有する患者を含む、再発寛解型多発性硬化症(RRMS)を有する患者における再発の頻度の軽減に適応がある。
【0003】
酢酸グラチラマーは、疾患の発症の原因となる免疫プロセスを改変することにより、多発性硬化症において作用すると考えられる。特に、多発性硬化症におけるCopaxone(登録商標)の作用機構は、T細胞活性の免疫調節によって少なくとも一部媒介されると考えられる。
【0004】
酢酸グラチラマーの製造期間内に、薬物の作用機構を考慮に入れた、速く、高感度で、信頼性が高く、費用効果のある効力アッセイが、医薬としての使用のための薬物ロット間で一貫した効力を証明するために必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、酢酸グラチラマー(GA)のための新規効力アッセイに関し、GAの試験ロットおよびGAの参照標準ロットを用いる刺激に応答してGA特異的T細胞により発現される少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAを定量し比較することによってGAの試験ロットの効力を決定する。GA特異的T細胞は、GAの試験ロットまたは参照標準ロットを用いて免疫化したマウスから得られる。このアッセイにおける使用のためのmRNA応答バイオマーカーを同定するための方法も記載される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
実施形態において、本発明は、GAの試験ロットの効力を決定するためのプロセスであって、試験動物を、規定量のGA参照標準ロットを用いて免疫化すること;免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること;所定量のGA参照標準ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの試験ロットの存在下で所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定し、所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;ならびに所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量とを比較し、それによって、GAの試験ロットの相対効力を決定することを含むプロセスに関する。
【0007】
関連する実施形態において、試験動物はマウスである。ある特定の実施形態においては、マウスはメスのSJL/J、BALB/cByJ、CD−1、C57BL/10J、または(SJL/JxBALB/c)F1マウスである。実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IFN−γ、TNF−α、IL−1b、IL−13、IL−17、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも1つの酢酸グラチラマー応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IL−17、IFN−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態において、少なくとも1つの酢酸グラチラマー応答バイオマーカーmRNAは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はCD69、CD25、またはその両方である。実施形態において、少なくとも1つのバイオマーカーmRNAは、マウスをGA参照標準ロットを用いて免疫化した9〜11日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。
【0008】
実施形態において、本発明のプロセスは、GAの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む。これらの実施形態において、所望の相対効力は、例えば、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約90%〜約125%であるか、または所望の相対効力は、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約95%〜約125%である。
【0009】
本発明の実施形態において、少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAは、リアルタイムPCRによって測定される。関連する実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、インキュベーションが開始された後約4時間〜約6時間で測定される。ある特定の実施形態において、タンパク質合成阻害剤、例えば、シクロヘキシミドを、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する。
【0010】
本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Copaxoneである。
【0011】
本発明はさらに、試験動物を、規定量のGA試験ロットを用いて免疫化すること;免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること;所定量のGA試験ロットの存在下で所定数の培養されたリンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料、および所定量のGAの参照標準の存在下で所定数の培養されたリンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;所定量のGA試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量、および所定量のGAの参照標準と共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;ならびに所定量のGAの参照標準と共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と、所定量のGA試験ロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量とを比較することを含む、GAの参照標準ロットの効力を決定するためのプロセスに関する。
【0012】
関連する実施形態において、試験動物はマウスである。ある特定の実施形態においては、マウスはメスのSJL/J、BALB/cByJ、CD−1、C57BL/10J、または(SJL/JxBALB/c)F1マウスである。実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IFN−γ、TNF−α、IL−1b、IL−13、IL−17、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IL−17、IFN−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はCD69、CD25、またはその両方である。実施形態において、少なくとも1つのバイオマーカーmRNAは、マウスをGA参照標準ロットを用いて免疫化した9〜11日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。
【0013】
実施形態において、本発明のプロセスは、GAの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む。これらの実施形態において、所望の相対効力は、例えば、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約90%〜約125%であるか、または所望の相対効力は、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約95%〜約125%である。
【0014】
本発明の実施形態において、少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAは、リアルタイムPCRによって測定される。関連する実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、インキュベーションが開始された後約4時間〜約6時間で測定される。ある特定の実施形態において、タンパク質合成阻害剤、例えば、シクロヘキシミドを、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する。
【0015】
本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Copaxoneである。
【0016】
また、GAを含有する医薬組成物を調製するためのプロセスであって、プロセス中に、GAの試験ロットを試験して、それがGA参照標準ロットの効力と比べて所望の効力を有するかどうかを決定し、プロセスが、GAの試験ロットの効力を決定すること、およびそれを参照標準ロットの効力と比較することを含み、GAの試験ロットと参照標準ロットの効力が、規定量のGA参照標準ロットを用いて免疫化された試験哺乳動物から取り出したリンパ節細胞の培養物の細胞中で生成された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定することにより決定され、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を、所定量のGA参照標準ロットの存在下でインキュベートし、実質的に同一の所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を、同じ所定量のGAの試験ロットの存在下でインキュベートし、GAの試験ロットが参照標準ロットの効力と比べて所望の効力を有すると決定された場合にのみ、GAの試験ロットを医薬組成物に混合するプロセスも提供される。
【0017】
関連する実施形態において、試験動物はマウスである。ある特定の実施形態においては、マウスはメスのSJL/J、BALB/cByJ、CD−1、C57BL/10J、または(SJL/JxBALB/c)F1マウスである。実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IFN−γ、TNF−α、IL−1b、IL−13、IL−17、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IL−17、IFN−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はCD69、CD25、またはその両方である。実施形態において、少なくとも1つのバイオマーカーmRNAは、マウスをGA参照標準ロットを用いて免疫化した9〜11日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。
【0018】
実施形態において、本発明のプロセスは、GAの試験ロットが所望の相対効力を有するかどうかを決定することをさらに含む。これらの実施形態において、所望の相対効力は、例えば、酢酸グラチラマー参照標準ロットの効力の少なくとも約90%〜約125%であるか、または所望の相対効力は、酢酸グラチラマー参照標準ロットの効力の少なくとも約95%〜約125%である。
【0019】
本発明の実施形態において、少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAは、リアルタイムPCRによって測定される。関連する実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、インキュベーションが開始された後約4時間〜約6時間で測定される。ある特定の実施形態において、タンパク質合成阻害剤、例えば、シクロヘキシミドを、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する。
【0020】
本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Copaxoneである。
【0021】
本発明はさらに、GA T細胞効力アッセイにおける使用のためのGA応答バイオマーカーmRNAを同定する方法であって、試験動物を規定量のGAを用いて免疫化すること;試験動物を対照抗原を用いて免疫化すること;GAで免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養し、対照抗原で免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を別途培養すること;所定量のGAの存在下で、GAで免疫化した試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料、および所定量のGAの試験ロットの存在下で、対照抗原で免疫化した試験動物から取り出した所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;GAで免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中で候補応答バイオマーカーmRNAの量を測定し、対照抗原で免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中で候補応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;ならびにGAで免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中の候補応答バイオマーカーmRNAの量を、対照抗原で免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中の候補応答バイオマーカーmRNAの量と比較することを含み、GAで免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された候補応答バイオマーカーmRNAの量が、対照抗原で免疫化した試験動物に由来するインキュベートされたリンパ節細胞中の候補応答バイオマーカーmRNAの量よりも有意に高い場合、候補応答バイオマーカーmRNAが応答バイオマーカーmRNAとして同定される方法に関する。
【0022】
ある特定の実施形態においては、本発明は、GAの試験ロットの効力および交差効力を決定するためのプロセスであって、第1の試験動物を、規定量のGA参照標準ロットを用いて免疫化すること;第2の試験動物を、規定量のGA試験ロットを用いて免疫化すること;免疫化した第1の試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養し、免疫化した第2の試験動物から取り出したリンパ節細胞を別途培養すること;所定量のGA参照標準ロットの存在下で、免疫化した第1の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの試験ロットの存在下で、免疫化した第1の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;所定量のGA参照標準ロットの存在下で、免疫化した第2の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートし、所定量のGAの試験ロットの存在下で、免疫化した第2の試験動物に由来する所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料をインキュベートすること;所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量、および所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量、および所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較し、それによって、GAの試験ロットの相対効力を決定すること;所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較し、それによって、GAの参照標準ロットの相対効力を決定すること;所定量のGAの試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較し、それによって、GAの試験ロットの交差効力を決定することを含むプロセスに関する。
【0023】
これらの実施形態において、第1の試験動物および第2の試験動物を、同じマウス系統のマウス:HLA適合マウス;同腹子、および双子から選択することができる。実施形態において、第1の試験動物および第2の試験動物は、同じマウス系統のものであり、ここでマウス系統は、メスのCSJLF1/JRj、メスのSJL/J、メスのBALB/cByJ、メスのCD−1、メスのC57BL/10J、およびメスの(SJL/JxBALB/c)F1から選択される。実施形態において、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。関連する実施形態においては、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカインをコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカインはIL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IFN−γ、TNF−α、IL−1b、IL−13、IL−17、またはその任意の組合せである。ある特定の実施形態においては、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IL−17、IFN−γ、またはその任意の組合せをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態においては、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAは、サイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写され、ここで、サイトカイン受容体はCD69、CD25、またはその両方である。実施形態において、少なくとも1つのバイオマーカーmRNAは、GA参照標準ロットを用いてマウスを免疫化した9〜11日後にリンパ節細胞の培養物中で測定される。
【0024】
実施形態において、本発明のプロセスは、GAの試験ロットが所望の相対効力、所望の相対交差効力、またはその両方を有するかどうかを判定することをさらに含む。これらの実施形態においては、所望の相対効力もしくは所望の相対交差効力は、例えば、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約90%〜約125%であるか、または所望の相対効力もしくは所望の相対交差効力は、GA参照標準ロットの効力の少なくとも約95%〜約125%である。
【0025】
本発明の実施形態において、少なくとも1つの応答バイオマーカーmRNAは、リアルタイムPCRによって測定される。関連する実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、インキュベーションが開始された後約4時間〜約6時間で測定される。ある特定の実施形態において、タンパク質合成阻害剤、例えば、シクロヘキシミドを、リンパ節細胞とGA参照標準ロットとのインキュベーション、およびリンパ節細胞とGAの試験ロットとのインキュベーションに添加する。
【0026】
本発明のプロセスの実施形態においては、参照標準ロットは、Copaxoneである。
【0027】
本発明はまた、GAの第2のロットの効力を決定するためのプロセスであって、試験動物を、規定量の第1のGAロットを用いて免疫化すること;免疫化した試験動物から取り出したリンパ節細胞を培養すること;所定量の第1のGAロットの存在下で、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を培養し、所定量のGAの第2のロットの存在下で、所定数の培養リンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を培養すること;所定量の第1のGAロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量、および所定量のGAの第2のロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中の少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を測定すること;ならびに所定量のGAの第2のロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量の第1のGAロットと共にインキュベートされたリンパ節細胞中で測定された少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較し、それによって、GAの第2のロットの相対効力を決定することを含むプロセスも提供する。これらの実施形態においては、第1のGAロットはCopaxone、GAの参照標準ロット、またはGAの試験ロットであってもよい。これらの実施形態においては、第2のGAロットは、Copaxone、GAの参照標準ロット、またはGAの試験ロットであってもよい。
【0028】
参照による組込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0029】
本発明の新規特徴を、添付の特許請求の範囲における特殊性と共に説明する。本発明の特徴および利点のより良好な理解を、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明、および以下の添付図面に対する参照により得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】異なる濃度のGAに応答して一次LN細胞中で発現されるmIL−2 mRNA。この図面は、本明細書の表6に提示されるデータのグラフを示す。GAで免疫化したマウスに由来するLN細胞を、異なる濃度のGAまたはCopaxoneでエクスビボ(ex vivo)で刺激し、mIL−2 mRNAを測定した。IL−2 mRNAレベルは、DCCM1(培養培地)対照と比較した倍数増加として表される。A.6つのGA濃度(1、2.5、5、10、15および25μg/mL)を、LN細胞の刺激のために用いた。B.5つのGA濃度(1、2.5、5、10および15μg/mL)を、LN細胞の刺激のために用いた。AとBの両方について、菱形は、GMA(酢酸グラチラマー、Mylan Pharmaceuticals,Inc.)で刺激した第3群の細胞(GAで免疫化したマウスに由来する)中でのmIL−2 mRNAの発現を示す。四角は、Copaxone(Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)で刺激した第3群の細胞中での発現を示す。三角は、GMAで刺激した第4群の細胞(マンニトールで免疫化したマウスに由来する)中での発現を示す。Xは、Copaxoneで刺激した第4群の細胞を示す。データは半対数上でプロットされる。さらに、対数トレンドライン/回帰をプロットに加えた。全てのr値は0.90%または90%を超えるものであった。
【図2】GA刺激に応答して一次LN細胞中で発現されるサイトカインmRNA。この図面は、本明細書の表8〜12に提示されるデータの概要を示す。GAで免疫化したマウスに由来するLN細胞を、GAでエクスビボで刺激し、サイトカインmRNAを、示されるように刺激後4時間(明るいバー)および刺激後6時間(暗いバー)で測定した。サイトカインmRNAレベルは、DCCM1(培養培地)対照と比較した倍数増加として表される。
【図3】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化CD−1マウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−2およびIL−4。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのIL−2 mRNA発現。B.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのIL−4 mRNA発現。
【図4】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化CD−1マウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−5およびIL−10。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのIL−5 mRNA発現。B.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのIL−10 mRNA発現。
【図5】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化CD−1マウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−13およびIFN−γ。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのIL−13 mRNA発現。B.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのIFN−γ mRNA発現。
【図6】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化マウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:TNF−αおよびIL−2。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.CD−1マウス系統に由来するLN細胞中でのTNF−α mRNA発現。B.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−2 mRNA発現。
【図7】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化BALB/cByJマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−4およびIL−5。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−4 mRNA発現。B.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−5 mRNA発現。
【図8】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化BALB/cByJマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−10およびIL−13。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−10 mRNA発現。B.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−13 mRNA発現。
【図9】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化BALB/cByJマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IFN−γおよびTNF−α。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのIFN−γ mRNA発現。B.BALB/cByJマウス系統に由来するLN細胞中でのTNF−α mRNA発現。
【図10】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化SJL/Jマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−2およびIL−4。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−2 mRNA発現。B.SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−4 mRNA発現。
【図11】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化SJL/Jマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−5およびIL−10。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−5 mRNA発現。B.SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−10 mRNA発現。
【図12】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化SJL/Jマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:IL−13およびIFN−γ。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。A.SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのIL−13 mRNA発現。B.SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのIFN−γ mRNA発現。
【図13】GAを用いる刺激に応答したGA免疫化SJL/Jマウスに由来する一次LN細胞中の応答バイオマーカーmRNA発現レベル:TNF−α。対照に対する倍数変化として表されるmRNAレベルを、GA刺激濃度の関数としてプロットする。グラフは、SJL/Jマウス系統に由来するLN細胞中でのTNF−α mRNA発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
酢酸グラチラマー(GA)
GAは、それぞれ、0.141、0.427、0.095、および0.338の平均分子画分を有する4つの天然アミノ酸:L−グルタミン酸、L−アラニン、L−チロシン、およびL−リシンを含有する合成ポリペプチドの酢酸塩からなる。GAの平均分子量は、5,000〜9,000ダルトンである。化学的には、GAは、L−アラニン、L−リシンおよびL−チロシン、酢酸(塩)を含むL−グルタミン酸ポリマーと指定される。
【0032】
GAの実験式は、(CNO・CNO・C14・C11NO・xC(CAS−147245−92−9、Physician’s Desk Reference)である。
【0033】
本明細書で用いられる場合、「GA」とは、特に記述しない限り、例えば、Mylan Pharmaceuticals,Inc.により製造されるGAである「GMA」、およびTeva Pharmaceuticals USA,Inc.により製造されるGAである「Cop」または「Copaxone」を含むGAを一般に指す。
【0034】
酢酸グラチラマー製造ロットを試験するための効力アッセイ
本発明は、医薬としての使用のために許容されるGAの製造における薬物ロット間の一貫した効力を証明するのに有用な効力アッセイに関する。それは、認可プロセス中の薬物の効力試験を要求し、認可後のロット間一貫性を決定するために用いることができる効力アッセイの開発を要求する、薬物認可当局にとって典型的なものである。そのようなアッセイは、日常的な製造中のロット一貫性を確保するだけでなく、製造プロセスの変化後の薬物ロットを評価するためにも有用である。
【0035】
効力は、製品特異的尺度であり、それぞれの製品について個別にアッセイを評価しなければならない。多発性硬化症(MS)におけるGAの作用機構は、T細胞活性の免疫調節によって一部媒介されると考えられる。従って、GAに対するT細胞の免疫応答は、GA溶液中に存在するエピトープの特異的および高感度の尺度である。溶液中に存在する、異なるが非常に類似するペプチド間を識別するT細胞の独自の能力のため、培養物中でのサイトカイン分泌プロファイルおよびGA特異的T細胞の免疫活性の分析は、GAのロット間の免疫学的に関連する差異を識別することができる。これに関して、例えば、GAの参照標準ロットでプライミングされ、例えば、GAの試験ロットでチャレンジされた、および/またはその逆の、動物におけるT細胞応答により示される免疫学的同一性は、参照標準ロットと試験ロットとが同一であることを示してもよい。その後のチャレンジに応答したプライミングされたT細胞によるサイトカインの放出は、T細胞応答の免疫学的同一性の1つのさらなる尺度である。サイトカインの放出プロファイルは、所与のGAロット中に存在する特定のエピトープ中のわずかな差異を潜在的に検出することができる。
【0036】
本発明の実施形態において、製造または試験ロットにおけるGAの相対効力は、GAの試験ロットに対するT細胞の免疫応答を表す値を、GAの参照標準ロットに対するT細胞の同応答を表す値と比較することによって決定される。この効力決定は、GAの試験ロットの刺激能力を説明する。本発明の方法においては、試験動物を、規定量、または所定量のGA参照標準ロットで免疫化し、動物から取り出したリンパ節に由来するリンパ節細胞を培養する。培養リンパ節細胞の試料を、規定量、または所定量のGA参照標準ロットとのインキュベーションにより刺激し、培養リンパ節細胞の第2の試料を、同じ規定量、または所定量のGA製造ロットもしくは試験ロットとのインキュベーションにより刺激する。次いで、GA応答バイオマーカーmRNAの量を、各試料中で測定し、その量を比較して相対効力に達する。
【0037】
別の実施形態においては、GAの相対交差効力を決定する。相対交差効力は、免疫間の効力を比較する、すなわち、それは、異なる動物から得た試験および/または参照標準GA刺激T細胞(または比較される任意の2つのGAロットで刺激したT細胞)の効力を比較するものであり、ここで、それぞれの動物はGAの試験または参照標準ロットのいずれかで免疫化したものである。この尺度は、GAの試験ロットの免疫化能力、例えば、免疫応答を惹起するGA試験ロットの能力における洞察を提供する。この尺度はまた、GAの参照標準ロットの免疫化能力における洞察も提供する。これらの実施形態において、プロセスは、少なくとも2つの試験動物を、第1にGA参照標準ロットを用いて、第2に規定量のGA試験ロットを用いて免疫化することを含む。免疫化した第1および第2の試験動物から取り出したリンパ節細胞を、別々に培養する。所定数の培養リンパ節細胞をそれぞれ含有する、各動物から取り出した培養リンパ節細胞の試料を別々に作成する。各試料を、所定量のGA参照標準ロットおよび所定量のGAの試験ロットと共に別々にインキュベートする。従って、少なくとも4つのインキュベーションまたは刺激試料を、例えば、表Aに示されるように作成する。
【0038】
【表1】
【0039】
少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定し(インキュベーションAで表される)、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第1の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定する(インキュベーションBで表される)。同様に、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA参照標準ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定し(インキュベーションCで表される)、少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、所定量のGA試験ロットと共にインキュベートされた、免疫化した第2の試験動物に由来するリンパ節細胞中で測定する(インキュベーションDで表される)。
【0040】
実施形態において、効力決定は上記のように行われ、ここで、インキュベーションBにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、インキュベーションAにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較する。実施形態においては、インキュベーションCにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、インキュベーションDにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較する。
【0041】
交差効力を決定するために、インキュベーションCにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、インキュベーションAにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較する。実施形態においては、インキュベーションBにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量を、インキュベーションDにおける少なくとも1つのGA応答バイオマーカーmRNAの量と比較する。
【0042】
例えば、本明細書の表29(IL−2)、表31(IL−4)および表35(IL−13)に提示された実施例から取り上げられる、表Bに記載のデータを用いて、交差効力の算出を以下に示されるように実行する。
【0043】
【表2】
【0044】
IL−2について、Copaxoneの交差効力は、以下のように算出される。
【0045】
C/A=17.5/20.0=0.875、または87.5%。
【0046】
IL−2について、GMAの交差効力は、以下のように算出される。
【0047】
B/D=16.9/15.7=1.08、または108%。
【0048】
IL−4について、Copaxoneの交差効力は、以下のように算出される。
【0049】
C/A=21.8/22.6=0.965、または96.5%。
【0050】
IL−4について、GMAの交差効力は、以下のように算出される。
【0051】
B/D=18.8/18.3=1.03、または103%。
【0052】
IL−13について、Copaxoneの交差効力は、以下のように算出される。
【0053】
C/A=17.5/13.5=1.3、または130%。
【0054】
IL−13について、GMAの交差効力は、以下のように算出される。
【0055】
B/D=8.6/11.5=0.748、または74.8%。
【0056】
実施形態において、効力は、2つの製造ロットの比較に基づく。実施形態において、本発明のプロセスは、GAの医薬組成物へのGAの製造ロットの潜在的な添加の前、添加の後、さもなければ適切と見なされる時点で用いられる。
【0057】
それぞれ「Process for the Measurement of the Potency of Glatiramer Acetate」の表題の、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,429,374号(2008年9月30日発行)、第7,923,215号(2011年4月12日発行)、および米国特許出願公開第2011/0189706号(2011年8月4日公開)は、分泌サイトカイン(タンパク質)レベルを測定するGA効力アッセイを記載する。
【0058】
本発明の方法においては、1または複数の応答バイオマーカーmRNAの発現レベルを測定する。mRNA発現レベルはタンパク質発現と同等であるとは限らない。従って、mRNA発現レベルを用いて、分泌タンパク質アッセイを用いた場合利用可能ではない応答バイオマーカーに関する情報を提供することができる。例えば、mRNAアッセイの1つの利点は、mRNAが、mRNAから誘導される分泌タンパク質よりもはるかに早い検出に利用可能であり、より迅速なアッセイを得ることができることである。タイミングの問題に加えて、ある特定の応答バイオマーカーの用量応答効果は、2つの型のアッセイ間で異なることが観察された。重要なことは、米国特許第7,429,374号により検出不可能と記載されたサイトカインが、GAで免疫化したマウスに由来する細胞のGA刺激後に、本明細書に示されるmRNAアッセイによって明確に検出されたことである。
【0059】
実施形態において、mRNA増幅によって定量を実行する場合、データを、内部対照、例えば、GAPDHまたはβ−アクチンなどの参照またはハウスキーピング遺伝子の発現に対して正規化することができる。さらに、効力または交差効力を、本明細書の実施例に記載のように、DCCM−1非刺激データが対照である、対照と比較した倍数増加を単位として表すことができる。実施形態においては、効力または交差効力は、試料中のGA応答バイオマーカーmRNAについての対照に対する倍数変化として表される。実施形態においては、試料中のGA応答バイオマーカーmRNAについての対照に対する倍数変化は、1)同じ試料を用いて得た参照またはハウスキーピング遺伝子に対して応答バイオマーカーmRNAのレベルを正規化すること、および2)応答バイオマーカーmRNAの正規化されたレベルを、陰性対照レベルにより除算することにより算出される。実施形態においては、陰性対照レベルは、培養培地対照である。
【0060】
実施形態においては、効力または交差効力の評価のために、詳細な用量応答曲線の統計的比較を実施して、用量応答曲線の類似性を証明することができる。文献中で、または当業者には公知の任意の方法を用いて、用量応答曲線の類似性を証明することができる。実施形態において、用量応答曲線間の類似性は、用量応答曲線間の0%〜約15%の分散率に基づいて決定される。実施形態において、用量応答曲線間の類似性は、用量応答曲線間の0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、または約15%の分散率に基づいて決定される。実施形態において、用量応答曲線間の類似性は、用量応答曲線間の0%〜約3%、0%〜約4%、0%〜約5%、0%〜約6%、0%〜約7%、0%〜約8%、0%〜約9%、0%〜約10%、0%〜約11%、0%〜約12%、0%〜約13%、0%〜約14%、約1%〜約3%、約1%〜約4%、約1%〜約5%、約1%〜約6%、約1%〜約7%、約1%〜約8%、約1%〜約9%、約1%〜約10%、約1%〜約11%、約1%〜約12%、約1%〜約13%、約1%〜約14%、約2%〜約4%、約2%〜約5%、約2%〜約6%、約2%〜約7%、約2%〜約8%、約2%〜約9%、約2%〜約10%、約2%〜約11%、約2%〜約12%、約2%〜約13%、約2%〜約14%、約2%〜約15%、約3%〜約5%、約3%〜約6%、約3%〜約7%、約3%〜約8%、約3%〜約9%、約3%〜約10%、約3%〜約11%、約3%〜約12%、約3%〜約13%、約3%〜約14%、約3%〜約15%、約4%〜約7%、約4%〜約8%、約4%〜約9%、約4%〜約10%、約4%〜約11%、約4%〜約12%、約4%〜約13%、約4%〜約14%、約4%〜約15%、約5%〜約8%、約5%〜約9%、約5%〜約10%、約5%〜約11%、約5%〜約12%、約5%〜約13%、約5%〜約14%、約5%〜約15%、約6%〜約9%、約6%〜約10%、約6%〜約11%、約6%〜約12%、約6%〜約13%、約6%〜約14%、約6%〜約15%、約7%〜約10%、約7%〜約11%、約7%〜約12%、約7%〜約13%、約7%〜約14%、約7%〜約15%、約8%〜約11%、約8%〜約12%、約8%〜約13%、約8%〜約14%、約8%〜約15%、約9%〜約12%、約9%〜約13%、約9%〜約14%、約9%〜約15%、約10%〜約13%、約10%〜約14%、約10%〜約15%、約11%〜約14%、約11%〜約15%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、または約15%の分散率に基づいて決定される。
【0061】
当業界で公知であり、文献中に記載された任意の適切なRT−PCR定量法の使用が企図される。定量法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wong and Medrano, 2005, Biotechniques 39: 57-85, 「Real-Time PCR for mRNA Quantitation」に記載されている。
【0062】
実施形態において、公知の方法により当業者によって有用と確認された任意の参照またはハウスキーピング遺伝子を、本発明の方法において用いる。実施形態において、用いられる参照またはハウスキーピング遺伝子は、GAPDH、β−アクチン、Atp5b、b2m、Cyc1、Hprt、Gapdh、18S RNA、およびRp113aから選択される。
【0063】
本発明の実施形態において、相対効力および相対交差効力を決定するために行われる比較は、観察されるmRNAバイオマーカー発現の量の比、割合、またはパーセンテージとして表される。
【0064】
本発明の実施形態において、GAの試験ロットの効力または交差効力を、GAの参照標準ロットの効力または交差効力と比較して、GAの試験ロットの相対効力または交差効力を得る。相対効力または交差効力が100%(1.0と表すこともできる)である実施形態においては、GAの試験ロットとGAの参照標準ロットの効力または交差効力は等しい。実施形態において、望ましい相対効力は約80%〜約120%である。実施形態において、望ましい相対効力は約85%〜約115%である。実施形態において、望ましい相対効力は約90%〜約110%である。実施形態において、望ましい相対交差効力は約70%〜約130%である。実施形態において、望ましい相対交差効力は約65%〜約135%である。ある特定の実施形態において、参照標準ロットの効力または交差効力と比較した望ましい効力または望ましい交差効力(望ましい相対効力または望ましい相対交差効力)は、約もしくは少なくとも約65%、約もしくは少なくとも約66%、約もしくは少なくとも約67%、約もしくは少なくとも約68%、約もしくは少なくとも約69%、約もしくは少なくとも約70%、約もしくは少なくとも約71%、約もしくは少なくとも約72%、約もしくは少なくとも約73%、約もしくは少なくとも約74%、約もしくは少なくとも約75%、約もしくは少なくとも約75%、約もしくは少なくとも約76%、約もしくは少なくとも約77%、約もしくは少なくとも約78%、約もしくは少なくとも約79%、約もしくは少なくとも約80%、約もしくは少なくとも約81%、約もしくは少なくとも約82%、約もしくは少なくとも約83%、約もしくは少なくとも約84%、約もしくは少なくとも約85%、約もしくは少なくとも約86%、約もしくは少なくとも約87%、約もしくは少なくとも約88%、約もしくは少なくとも約89%、約もしくは少なくとも約90%、約もしくは少なくとも約91%、約もしくは少なくとも約92%、約もしくは少なくとも約93%、約もしくは少なくとも約94%、約もしくは少なくとも約95%、約もしくは少なくとも約96%、約もしくは少なくとも約97%、約もしくは少なくとも約98%、約もしくは少なくとも約99%、約もしくは少なくとも約100%、約もしくは少なくとも約101%、約もしくは少なくとも約102%、約もしくは少なくとも約103%、約もしくは少なくとも約104%、約もしくは少なくとも約105%、約もしくは少なくとも約106%、約もしくは少なくとも約107%、約もしくは少なくとも約108%、約もしくは少なくとも約109%、約もしくは少なくとも約110%、約もしくは少なくとも約111%、約もしくは少なくとも約112%、約もしくは少なくとも約113%、約もしくは少なくとも約114%、約もしくは少なくとも約115%、約もしくは少なくとも約116%、約もしくは少なくとも約117%、約もしくは少なくとも約118%、約もしくは少なくとも約119%、約もしくは少なくとも約120%、約もしくは少なくとも約121%、約もしくは少なくとも約122%、約もしくは少なくとも約123%、約もしくは少なくとも約124%、約もしくは少なくとも約125%、約もしくは少なくとも約126%、約もしくは少なくとも約127%、約もしくは少なくとも約128%、約もしくは少なくとも約129%、約もしくは少なくとも約130%、約もしくは少なくとも約131%、約もしくは少なくとも約132%、約もしくは少なくとも約133%、約もしくは少なくとも約134%、または約もしくは少なくとも約135%である。実施形態において、望ましい相対効力または交差効力は、約68%〜約132%、約70%〜約130%、約72%〜約128%、約75%〜約125%、約80%〜約120%、約85%〜約115%、約65%〜約110%、約68%〜約110%、約70%〜約110%、約72%〜約110%、約78%〜約110%、約80%〜約110%、約90%〜約110%、約95%〜約105%、約85%〜約110%、約90%〜約110%、約95%〜約110%、約96%〜約110%、約97%〜約110%、約98%〜約110%、約99%〜約110%、約100%〜約110%、約65%〜約105%、約68%〜約105%、約70%〜約105%、約72%〜約105%、約80%〜約105%、約85%〜約105%、約90%〜約105%、約95%〜約105%、約96%〜約105%、約97%〜約105%、約98%〜約105%、約99%〜約105%、約100%〜約105%、約65%〜約100%、約68%〜約100%、約70%〜約100%、約72%〜約100%、約75%〜約100%、約78%〜約100%、約80%〜約100%、約81%〜約100%、約82%〜約100%、約83%〜約100%、約84%〜約100%、約85%〜約100%、約86%〜約100%、約87%〜約100%、約88%〜約100%、約89%〜約100%、約90%〜約100%、約91%〜約100%、約92%〜約100%、約93%〜約100%、約94%〜約100%、約95%〜約100%、約96%〜約100%、約97%〜約100%、約98%〜約100%、約99%〜約100%、約95%〜約99%、約96%〜約99%、約97%〜約99%、約70%〜約135%、約75%〜約135%、約80%〜約135%、約85%〜約135%、約90%〜約135%、約75%〜約130%、約80%〜約130%、約85%〜約130%、約90%〜約130%、約80%〜約125%、約85%〜約125%、約90%〜約125%、約85%〜約120%、約90%〜約120%、または約95%〜約120%である。
【0065】
動物
本発明による試験動物または試験哺乳動物は、化合物の評価のために用いることができる任意の動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サルなどである。
【0066】
適切な試験動物を、本明細書の実施例に提供される教示と組み合わせた、当業者には公知の方法に従って同定することができる。例えば、多くのマウス系統が当業界で公知であり、Jackson Laboratories、Charles River、Taconicなどの供給源から購入可能である。入手可能な近交系マウス系統に関する情報は、公開された文献およびInternational Mouse Strain Resource(Eppig JT and Strivens M, 1999, Finding a mouse: the International Mouse Strain Resource (IMSR). Trends in Genetics 15: 81-82)を含むデータベース中で入手可能である。いくつかのマウス系統におけるサイトカイン分泌レベルの増加の評価が、本明細書の実施例に記載される。実施例は、本発明の方法における潜在的な測定のためのサイトカインをコードする遺伝子に由来する応答バイオマーカーmRNAの評価をさらに記載する。
【0067】
実施形態において、試験動物はマウスである。実施形態において、マウス系統はMHCハプロタイプb、d、またはs2を有する。実施形態において、マウスの系統は、CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD−1、C57BL/10J、または(SJL/JxBALB/c)F1である。実施形態において、マウスは、メスのCSJLF1/JRj、メスのSJL/J、メスのBALB/cByJ、メスのCD−1、メスのC57BL/10J、またはメスの(SJL/JxBALB/c)F1マウスである。
【0068】
それぞれ異なるGAロットで免疫化した異なるマウスに由来する試料中での応答バイオマーカーmRNA発現を比較することにより交差効力が決定される実施形態においては、マウスは免疫学的に関連する遺伝子座に関して実質的に同じ遺伝子型のものである。実施形態において、マウスは、同じマウス系統のマウス、HLA適合マウス;同腹子;および双子から選択される。実施形態において、マウスは遺伝的に同一であるか、または実質的に遺伝的に同一である。
【0069】
免疫化
本発明の方法において有用な動物免疫化手順は、本明細書ならびに公開された文献、例えば、米国特許第7,429,374号および第7,923,215号に記載されている。GAに対してT細胞応答を誘導する他の有効な免疫化手順は、当業者によって特定可能である。実施形態においては、マウスを、足蹠(footpad)(足底内)および/または下肢/膝注射により、CFA乳濁液中の250μgのGAまたはCFA乳濁液中のマンニトールを用いて免疫化する。実施形態において、マウスを、約200〜約500μg、約200〜約450μg、約200〜約350μg、約200〜約300μg、約200〜約250μg、約250〜約500μg、約250〜約450μg、約250〜約400μg、約250〜約350μg、または約250〜約300μgのGAを用いて免疫化する。
【0070】
実施形態において、27−Gの1/2インチ針を有する1mLの注射筒を用いて4つの足蹠それぞれへの注射により、8週齢の動物を免疫化する。足底内注射のために、0.1mLの全注射容量(それぞれの前足蹠中に約10μL、およびそれぞれの後足蹠中に40μL)を用いてマウスを免疫化することができる。皮下(例えば、下肢)注射のために、それぞれのマウスを、0.1mLの全注射容量(例えば、それぞれの前下肢中に約25μL、および後肢のそれぞれの膝に25μL)を用いて免疫化することができる。
【0071】
T細胞培養物
本発明の方法において、試験動物中の任意の供給源に由来するT細胞のエクスビボでのGA刺激が企図される。実施形態においては、T細胞は、リンパ節、脾臓、骨髄、または末梢血に由来する。T細胞を、本明細書の実施例に記載のように、または当業界で公知の任意の方法により、または文献中で公開された方法を用いて取得することができる。
【0072】
例として、T細胞は、免疫化したマウス、および以下のように調製される一次培養物から得られる:免疫化の10日後、免疫化した動物を頸椎脱臼により犠牲にする。免疫化したマウスからの腋下(axillary)および腋窩(popliteal)領域中のリンパ節を除去し、5mLの氷冷滅菌RPMI−1640培地を含有するペトリ皿にプールする。無傷のリンパ節を5.0mLの氷冷滅菌RPMI1640培地中で3回洗浄する。滅菌注射筒のプランジャ端部でLNを圧迫することにより、LN細胞を単離する。細胞懸濁液を最初に100μmのナイロン細胞ストレーナーに通過させた後、40mLの氷冷RPMI−1640培地で1回洗浄する。4℃で10分間、約200xgで遠心分離した後、細胞計数のために細胞ペレットを40mLのRPMI−1640培地中に再懸濁する。
【0073】
トリパンブルー色素排除法を用いて、以下のように懸濁液中の生細胞の細胞密度を決定することができる:細胞計数のために、0.1mLの細胞懸濁液を、0.65mLの1X DPBSおよび0.25mLの4%トリパンブルー溶液を含む清潔な滅菌マイクロ遠心管に移した後、計数チャンバに20μLのトリパンブルー細胞懸濁液混合物を添加する。細胞密度および生存能力を、Auto T4 Cellometerを用いて測定する。細胞計数後、LN細胞を4℃で10分間、約200xgで遠心分離し、1.0x10細胞/mLの細胞密度でDCCM−1富化培地中に再懸濁する。LN細胞を、薬物処理(刺激)のために24穴組織培養プレート中に播種することができる。
【0074】
実施形態において、LN細胞を、GAに対する免疫応答が生じるのに十分な時間の後、例えば、免疫化の約9〜11日後にマウスから取得する。
【0075】
酢酸グラチラマー刺激
T細胞、例えば、LN細胞を、当業界で公知の、または文献に記載された任意の好適な方法に従って、抗原(GA)で刺激することができる。例えば、所定数のLN細胞、例えば、GAで免疫化した動物に由来する0.5mLの細胞(5x10細胞/ウェル)を、望み通り所定量のGAの参照標準ロットで刺激することができる。別の試料中で、同じ所定数のLN細胞を、同じ所定量のGAの試験ロットで刺激することができる。100μLのGA(20mg/mL)を19.9mLのDCCM−1富化培地に添加し、望み通りに異なる濃度のGA試料を調製するのに有用な100μg/mLのストック溶液を得ることにより、GA希釈試料を調製することができる。
【0076】
例えば、24穴組織培養プレート中で、所定量のGA保存溶液の試験ロットまたは参照標準ロットを、所定数のLN細胞を含有するウェルに添加して、所望の濃度のGAを得る。同様にマンニトールで免疫化した対照動物に由来する同じ所定数のT細胞を、同じ手順を用いて、同じ所定量のGAのロットで処理することができる。
【0077】
本発明の実施形態においては、試験動物を規定量のGA参照標準で免疫化する。免疫化した動物に由来する所定数のリンパ節細胞を含有する少なくとも1つの試料を、GA参照標準の存在下でインキュベートし、免疫化した動物に由来するリンパ節細胞の少なくとも1つの試料を、GAの試験ロットの存在下でインキュベートする。この刺激は、免疫応答に含まれる分子、例えば、サイトカインおよびサイトカイン受容体をコードするmRNAの発現を誘導することができる。
【0078】
実施形態において、リンパ節細胞の試料を、少なくとも約0.3μg/mL〜約100μg/mLの濃度のGAと共にインキュベートする。実施形態において、濃度は、少なくとも約0.3μg/mL、少なくとも約0.4μg/mL、少なくとも約0.5μg/mL、少なくとも約0.6μg/mL、少なくとも約0.7μg/mL、少なくとも約0.8μg/mL、少なくとも約0.9μg/mL、少なくとも約1μg/mL、少なくとも約1.5μg/mL、少なくとも約2μg/mL、少なくとも約2.5μg/mL、少なくとも約3μg/mL、少なくとも約3.5μg/mL、少なくとも約4μg/mL、少なくとも約4.5μg/mL、少なくとも約5μg/mL、少なくとも約5.5μg/mL、少なくとも約6μg/mL、少なくとも約6.5μg/mL、少なくとも約7μg/mL、少なくとも約7.5μg/mL、少なくとも約8μg/mL、少なくとも約8.5μg/mL、少なくとも約9μg/mL、少なくとも約9.5μg/mL、少なくとも約10μg/mL、少なくとも約10.5μg/mL、少なくとも約11μg/mL、少なくとも約11.5μg/mL、少なくとも約12μg/mL、少なくとも約12.5μg/mL、少なくとも約13μg/mL、少なくとも約13.5μg/mL、少なくとも約14μg/mL、少なくとも約14.5μg/mL、少なくとも約15μg/mL、少なくとも約15.5μg/mL、少なくとも約16μg/mL、少なくとも約16.5μg/mL、少なくとも約17μg/mL、少なくとも約17.5μg/mL、少なくとも約18μg/mL、少なくとも約18.5μg/mL、少なくとも約19μg/mL、少なくとも約19.5μg/mL、少なくとも約20μg/mL、少なくとも約21.5μg/mL、少なくとも約22μg/mL、少なくとも約22.5μg/mL、少なくとも約23μg/mL、少なくとも約24μg/mL、少なくとも約24.5μg/mL、少なくとも約25μg/mL、少なくとも約25.5μg/mL、少なくとも約26μg/mL、少なくとも約26.5μg/mL、少なくとも約27μg/mL、少なくとも約27.5μg/mL、少なくとも約28μg/mL、少なくとも約28.5μg/mL、少なくとも約29μg/mL、少なくとも約29.5μg/mL、少なくとも約30μg/mL、少なくとも約35μg/mL、少なくとも約40μg/mL、少なくとも約45μg/mL、少なくとも約50μg/mL、少なくとも約55μg/mL、少なくとも約60μg/mL、少なくとも約65μg/mL、少なくとも約70μg/mL、少なくとも約75μg/mL、少なくとも約80μg/mL、少なくとも約85μg/mL、少なくとも約90μg/mL、少なくとも約95μg/mL、または少なくとも約100μg/mLである。実施形態において、濃度は、約0.3〜約15μg/mL、約0.3〜約10μg/mL、約0.3〜約8μg/mL、約0.3〜約6μg/mL、約0.3〜約5μg/mL、約0.3〜約4μg/mL、約0.3〜約3μg/mL、約0.3〜約2.5μg/mL、約0.3〜約2μg/mL、約0.3〜約1μg/mL、約1〜約15μg/mL、約1〜約10μg/mL、約1〜約9μg/mL、約1〜約8μg/mL、約1〜約7μg/mL、約1〜約6μg/mL、約1〜約5μg/mL、約1〜約4μg/mL、約1〜約3μg/mL、約1〜約2.5μg/mL、約1〜約2μg/mL、約2〜約30μg/mL、約2〜約29μg/mL、約2〜約28μg/mL、約2〜27μg/mL、約2〜約26μg/mL、約2〜約25μg/mL、約2〜約24μg/mL、約2〜約23μg/mL、約2〜約22μg/mL、約2〜約21μg/mL、約2〜約20μg/mL、約2〜約19μg/mL、約2〜約18μg/mL、約2〜約17μg/mL、約2〜約16μg/mL、約2〜約15μg/mL、約2〜約14μg/mL、約2〜約13μg/mL、約2〜約12μg/mL、約2〜約11μg/mL、約2〜約10μg/mL、約2〜約5μg/mL、約2.5〜約30μg/mL、約2.5〜約29μg/mL、約2.5〜約28μg/mL、約2.5〜27μg/mL、約2.5〜約26μg/mL、約2.5〜約25μg/mL、約2.5〜約24μg/mL、約2.5〜約23μg/mL、約2.5〜約22μg/mL、約2.5〜約21μg/mL、約2.5〜約20μg/mL、約2.5〜約19μg/mL、約2.5〜約18μg/mL、約2.5〜約17μg/mL、約2.5〜約16μg/mL、約2.5〜約15μg/mL、約2.5〜約14μg/mL、約2.5〜約13μg/mL、約2.5〜約12μg/mL、約2.5〜約11μg/mL、約2.5〜約10μg/mL、約2.5〜約5μg/mL、約3〜約30μg/mL、約3〜約29μg/mL、約3〜約28μg/mL、約3〜27μg/mL、約3〜約26μg/mL、約3〜約25μg/mL、約3〜約24μg/mL、約3〜約23μg/mL、約3〜約22μg/mL、約3〜約21μg/mL、約3〜約20μg/mL、約3〜約19μg/mL、約3〜約18μg/mL、約3〜約17μg/mL、約3〜約16μg/mL、約3〜約15μg/mL、約3〜約14μg/mL、約3〜約13μg/mL、約3〜約12μg/mL、約3〜約11μg/mL、約3〜約10μg/mL、約3.5〜約30μg/mL、約3.5〜約29μg/mL、約3.5〜約28μg/mL、約3.5〜27μg/mL、約3.5〜約26μg/mL、約3.5〜約25μg/mL、約3.5〜約24μg/mL、約3.5〜約23μg/mL、約3.5〜約22μg/mL、約3.5〜約21μg/mL、約3.5〜約20μg/mL、約3.5〜約19μg/mL、約3.5〜約18μg/mL、約3.5〜約17μg/mL、約3.5〜約16μg/mL、約3.5〜約15μg/mL、約3.5〜約14μg/mL、約3.5〜約13μg/mL、約3.5〜約12μg/mL、約3.5〜約11μg/mL、約3.5〜約10μg/mL、約4〜約30μg/mL、約4〜約29μg/mL、約4〜約28μg/mL、約4〜27μg/mL、約4〜約26μg/mL、約4〜約25μg/mL、約4〜約24μg/mL、約4〜約23μg/mL、約4〜約22μg/mL、約4〜約21μg/mL、約4〜約20μg/mL、約4〜約19μg/mL、約4〜約18μg/mL、約4〜約17μg/mL、約4〜約16μg/mL、約4〜約15μg/mL、約4〜約14μg/mL、約4〜約13μg/mL、約4〜約12μg/mL、約4〜約11μg/mL、約4〜約10μg/mL、約4.5〜約30μg/mL、約4.5〜約29μg/mL、約4.5〜約28μg/mL、約4.5〜27μg/mL、約4.5〜約26μg/mL、約4.5〜約25μg/mL、約4.5〜約24μg/mL、約4.5〜約23μg/mL、約4.5〜約22μg/mL、約4.5〜約21μg/mL、約4.5〜約20μg/mL、約4.5〜約19μg/mL、約4.5〜約18μg/mL、約4.5〜約17μg/mL、約4.5〜約16μg/mL、約4.5〜約15μg/mL、約4.5〜約14μg/mL、約4.5〜約13μg/mL、約4.5〜約12μg/mL、約4.5〜約11μg/mL、約4.5〜約10μg/mL、約5〜約75μg/mL、約5〜約50μg/mL、約5〜約40μg/mL、約5〜約30μg/mL、約5〜約29μg/mL、約5〜約28μg/mL、約5〜27μg/mL、約5〜約26μg/mL、約5〜約25μg/mL、約5〜約24μg/mL、約5〜約23μg/mL、約5〜約22μg/mL、約5〜約21μg/mL、約5〜約20μg/mL、約5〜約19μg/mL、約5〜約18μg/mL、約5〜約17μg/mL、約5〜約16μg/mL、約5〜約15μg/mL、約5〜約14μg/mL、約5〜約13μg/mL、約5〜約12μg/mL、約5〜約11μg/mL、約5〜約10μg/mL、約10〜約75μg/mL、約10〜約50μg/mL、約10〜約50μg/mL、約10〜約30μg/mL、約10〜約25μg/mL、約10〜約20μg/mL、約10〜約15μg/mL、約15〜約75μg/mL、約15〜約50μg/mL、約15〜約40μg/mL、約15〜約30μg/mL、約15〜約25μg/mL、または約15〜約20μg/mLである。
【0079】
本発明の実施形態において、免疫化のために用いられるGAの参照標準ロットは、望み通りCopaxoneまたはGAの任意の他のロットである。これらの実施形態において、免疫化した動物に由来する細胞の別の試料を、免疫化のために用いられたGAのロットで処理し、細胞の第2の試料を、GAの第2のロット(試験ロット)でそれぞれ処理する。実施形態において、GAの参照標準ロットは、Copaxoneではない。これらの実施形態において、試験ロットは、望み通りCopaxoneまたはGAの任意の他のロットであってもよい。実施形態において、1つより多いGAの試験ロットを、第1の試験ロットと同時に評価する。
【0080】
実施形態において、交差効力を決定する場合、1匹より多いマウスを、それぞれ異なるロットのGAで免疫化する。免疫化したマウスのそれぞれから得られるLN細胞の別の試料を、異なるロットのGAで刺激し、それぞれの免疫化に由来する細胞をそれぞれ異なるロットのGAで別々に刺激する。
【0081】
応答バイオマーカーmRNA
GA刺激により潜在的に調節されるmRNA種が、本発明の方法における応答バイオマーカーとしての使用について企図される。実施形態において、応答バイオマーカーは、例えば、CD25、CD69、CD71、CD86(CD86分子)、CD137、CD154、CD278(ICOS、誘導性T細胞共刺激剤)、CD279、HLA−DR、GATA3(GATA結合タンパク質3)、HLA−DMA(主要組織適合複合体、クラスII、DMアルファ)、HLA−DMB(主要組織適合複合体、クラスII、DMベータ)、IFN−γ(インターフェロンガンマ)、IFN−γR2(インターフェロンガンマ受容体)、IL−2(インターロイキン2)、IL−4(インターロイキン4)、IL−5(インターロイキン5)、IL−6(インターロイキン6)、IL−8(CXCL−8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、IL−10(インターロイキン10)、IL−13(インターロイキン13)、IL−18(インターロイキン18)、IL−12RB1(インターロイキン12受容体、ベータ)、IL−17A(インターロイキン17A)、IL−17F(インターロイキン17F)、IL−18R1(インターロイキン18受容体1)、IL−2RA(インターロイキン2受容体、アルファ2)、IL−2RG(インターロイキン2受容体、ガンマ)、IL4−R(インターロイキン4受容体)、IL−6R(インターロイキン6受容体)、IL−21(インターロイキン21)、IL−22(インターロイキン22)、IL−1β(インターロイキン1−ベータ)、Tbx21(T−box 21)、TGFBR2(トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体II)、TNF(腫瘍壊死因子、TNF−α)、TNF−β(LT)、TGF−β、FOXP3(フォークヘッドボックスP3)、またはIL−10RB(インターロイキン10受容体、ベータ)をコードする遺伝子から転写されるmRNAである。これらの遺伝子の発現を、購入可能なサービス、試薬および/またはキット、例えば、Mouse WG−6 v2.0 Expression BeadChip Kit(Illumina,Inc.,San Diego,CA)を用いて評価することができる。
【0082】
実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、例えば、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、またはIL−17、IL−18、IL−21、IL−22、IFN−γ、TNF−α(TNF)、TNF−β(LT)、TGF−β、およびIL−1βから選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、例えば、CD25、CD69、CD71、CD86、CD137、CD154、CD278、CD279、GATA3、Tbx21、HLA−DMA、HLA−DMB、IFN−γR2、IL−12RB1、IL−2RA、IL−2RG、IL−4R、IL−6R、IL−10RB、TGFBR2、FOXP3、およびHLA−DRから選択される活性化マーカーまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、例えば、IL−8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、およびCXCL7から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、Th1関連サイトカイン、Th2関連サイトカイン、Th17関連サイトカイン、またはTFH関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、Th1関連サイトカインをコードする遺伝子から転写され、IFN−γ、IL−2、IL−1β、TNF−α、またはCXCL1である。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−5、IL−10、またはIL−13から選択されるTh2関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−17およびIL−22から選択されるTh17関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−21であるTFH関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−10およびTGF−βから選択される重要な調節関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される。
【0083】
実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、TNF−α、CD25、またはIL1−βをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、IL−22、TNF−α、CD25、またはIL1−βをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−13、またはTNF−αをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、またはCD25をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、またはCD25をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、またはTNF−αをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、IL−22、TNF−αをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、またはIFN−γをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、IL−5、IL−13、またはIL−17をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、CD25、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、IL−4、またはIL−13をコードする遺伝子から転写される。
【0084】
実施形態において、マウス系統は、CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD−1、C57BL/10J、または(SJL/JxBALB/c)F1である。実施形態において、マウス系統は、CSJLF1/JRj、SJL/J、BALB/cByJ、CD−1、C57BL/10J、または(SJL/JxBALB/c)F1であり、応答バイオマーカーmRNAは、マウスIL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、またはIL−17、IL−18、IL−21、IL−22、IFN−γ、TNF−α(TNF)、TNF−β(LT)、TGF−β、およびIL−1βをコードする遺伝子から転写される。実施形態において、1つより多い応答バイオマーカーmRNAを測定する。特定の実施形態において、1つより多い応答バイオマーカーmRNAを、例えば、多重PCRにより、同じ試料中で測定する。特定の実施形態においては、試験動物はSJL/Jマウスであり、応答バイオマーカーmRNAはmIL−2、mIL−4、mIL−5、mIL−13、またはmIFN−γをコードする遺伝子から転写される。特定の実施形態においては、試験動物はBALB/cByJマウスであり、応答バイオマーカーmRNAはmIL−2、mIFN−γ、mIL−4、mIL−5、mIL−10、またはmIL−13をコードする遺伝子から転写される。他の実施形態においては、試験動物はCD−1マウスであり、応答バイオマーカーmRNAはmIL−2、mIFN−γ、mIL−5、mIL−10、またはmIL−13をコードする遺伝子から転写される。ある特定の実施形態において、試験動物はC57BL/10Jマウスであり、応答バイオマーカーmRNAはmIL−2またはmIFN−γをコードする遺伝子から転写される。他の実施形態においては、試験動物は(SJL/JxBALB/C)F1マウスであり、応答バイオマーカーmRNAはmIFN−γ、mTNF−α、mIL−4、mIL−5、mIL−10、mIL−13、mIL−17、mCD69、またはmCD25をコードする遺伝子から転写される。実施形態において、試験動物はCSJLF1/JRjマウスであり、応答バイオマーカーmRNAはIL−4、IL−5、IL−13、またはIL−17をコードする遺伝子から転写される。
【0085】
本発明の特定の実施形態においては、試験動物は足底内注射により免疫化したBALB/cByJマウスであり、測定される応答バイオマーカーはIFN−γ、IL−4、またはIL−5である。実施形態において、試験動物は下肢注射により免疫化したBALB/cByJマウスであり、測定される応答バイオマーカーはIL−2である。他の実施形態において、試験動物は足底内注射により免疫化したCD−1マウスであり、測定される応答バイオマーカーはIL−2、IFN−γ、IL−4、IL−5、またはIL−10である。
【0086】
本発明はまた、本発明の効力アッセイにおいて測定できる応答バイオマーカーmRNA種を同定するための方法にも関する。当業者であれば、さらなる応答バイオマーカーmRNAを、GAで免疫化したマウスに由来するT細胞のGA刺激に応答して増加するサイトカインmRNA種の同定を証明する、本明細書に提示される教示に従って同定することができる。実施形態において、本発明の効力アッセイにおける使用のための適切な応答バイオマーカーは、GAで免疫化したマウスに由来するT細胞のGA刺激に応答して調節されると決定され、調節が2つ以上の反復試験において一貫することが見出されるmRNA種である。実施形態において、mRNA種は、GA刺激に応答して少なくとも約2倍〜約50倍、約2倍〜約45倍、約2倍〜約40倍、約2倍〜約35倍、約2倍〜約30倍、約2倍〜約25倍、約2倍〜約22倍、約2倍〜約20倍、約2倍〜約15倍、約2倍〜約12倍、約2倍〜約10倍、約2倍〜約9倍、約2倍〜約8倍、約2倍〜約7倍、約2倍〜約6倍、約2倍〜約5倍、約2倍〜約4倍、約3倍〜約50倍、約3倍〜約45倍、約3倍〜約40倍、約3倍〜約35倍、約3倍〜約30倍、約3倍〜約25倍、約3倍〜約22倍、約3倍〜約20倍、約3倍〜約15倍、約3倍〜約12倍、約3倍〜約10倍、約3倍〜約9倍、約3倍〜約8倍、約3倍〜約7倍、約3倍〜約6倍、約3倍〜約5倍、約4倍〜約50倍、約4倍〜約45倍、約4倍〜約40倍、約4倍〜約35倍、約4倍〜約30倍、約4倍〜約25倍、約4倍〜約22倍、約4倍〜約20倍、約4倍〜約15倍、約4倍〜約12倍、約4倍〜約10倍、約4倍〜約9倍、約4倍〜約8倍、約4倍〜約7倍、約4倍〜約6倍、約5倍〜約50倍、約5倍〜約45倍、約5倍〜約40倍、約5倍〜約35倍、約5倍〜約30倍、約5倍〜約25倍、約5倍〜約22倍、約5倍〜約20倍、約5倍〜約15倍、約5倍〜約12倍、約5倍〜約10倍、約5倍〜約9倍、約5倍〜約8倍、約5倍〜約7倍、約7倍〜約50倍、約7倍〜約45倍、約7倍〜約40倍、約7倍〜約35倍、約7倍〜約30倍、約7倍〜約25倍、約7倍〜約22倍、約7倍〜約20倍、約7倍〜約15倍、約7倍〜約12倍、約7倍〜約10倍、約7倍〜約9倍、約10倍〜約50倍、約10倍〜約45倍、約10倍〜約40倍、約10倍〜約35倍、約10倍〜約30倍、約10倍〜約25倍、約10倍〜約22倍、約10倍〜約20倍、約10倍〜約15倍、約15倍〜約50倍、約15倍〜約45倍、約15倍〜約40倍、約15倍〜約35倍、約15倍〜約30倍、約15倍〜約25倍、約15倍〜約22倍、約15倍〜約20倍、約20倍〜約50倍、約20倍〜約45倍、約20倍〜約40倍、約20倍〜約35倍、約20倍〜約30倍、約20倍〜約25倍、約25倍〜約50倍、約25倍〜約45倍、約25倍〜約40倍、約25倍〜約35倍、約25倍〜約30倍、約30倍〜約50倍、約30倍〜約45倍、約30倍〜約40倍、約30倍〜約35倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、少なくとも約12倍、少なくとも約13倍、少なくとも約14倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、少なくとも約30倍、少なくとも約2倍、少なくとも約35倍、少なくとも約40倍、少なくとも約45倍、または少なくとも約50倍調節される。潜在的な応答バイオマーカーmRNAの測定は、本明細書の他の場所に記載される。
【0087】
応答バイオマーカーmRNAの測定
応答バイオマーカーmRNA種を、任意数の購入可能なアッセイキットおよびシステムを用いて、または当業界で記載された任意の方法に従って定量的に測定できる。当業界で公知のmRNA発現レベルを測定するための任意の適切な定量法の本発明の方法における使用が企図される。例えば、mRNAの逆転写および増幅を、RT−PCR、およびリアルタイム逆転写PCR(qRT−PCR)などのPCR法を用いて実行することができる。遺伝子発現を定量化するためのPCR法は、例えば、VanGuilder, et al., 2008,「Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis」, Biotechniques 44: 619-626、およびBustin, et al., 2005,「Quantitative real-time RT-PCR - a perspective」,Journal of Molecular Endocrinology, 34:597-601に記載されており、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。マウスサイトカインmRNAの定量的PCRは、例えば、Overbergh, et al., 1999,「Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR」,Cytokine 11(4): 305-312に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれ、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−10、IL−12、p40、IL−13、IL−15、IFN−γ、TNF−α、TGF−βおよびiNOSを定量化するためのプローブおよびプライマーを記載している。
【0088】
マウスサイトカインRT−PCRキットは、例えば、Fisher Scientific,Life Technologies、およびSABiosciencesから広く入手可能である。例えば、Life Technologies Cytokine Mouse 20−Plex Panelは、IP−10、MIP−1α、MCP−1、IL−13、IFN−γ、IL−1α、FGF−Basic、IL−10、IL−12、IL−17、MIG、GM−CSF、TNF−α、IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、VEGF、およびKCの測定を同時に可能にするものである。SABiosciences Mouse Common Cytokines RTProfiler(商標)PCR Arrayを、84のサイトカイン遺伝子のサブセットを測定するためにカスタマイズすることができる。実施形態において、Life Technologiesから得られるTaqMan Universal PCR Master Mix (Cat.#4304437)およびマウスサイトカインIL−2(Cat.#4331182;ID Mm00434256_m1)、IL−4(Cat.#4331182;ID Mm00445259_m1)、IL−5(Cat.#4331182;ID Mm00439646_m1)、IL−10(Cat.#4331182;ID Mm00439614_m1)、IL−13(Cat.#4331182;ID Mm00434204_m1)、IFN−γ(Cat.#4331182;ID Mm01168134_m1)およびTNF−α(Cat.#4331182;ID Mm00443260_g1)のためのプライマー/プローブを用いる。
【0089】
実施形態において、Illumina MouseWG−6 v2.0 Expression BeadChip KitまたはMouseRef−8 v2.0 Expression BeadChip Kit(Illumina,Inc.,San Diego,CA)を用いて、転写物レベルを評価する。他の方法、例えば、RNA−Seq(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Nagalakshmi, et al., January 2010, RNA-Seq: A Method for Comprehensive Transcriptome Analysis, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Unit 4.11, Supplement 89, Copyright 2010 John Wiley & Sons, Inc.)を用いて、トランスクリプトーム分析を実行することができる。
【0090】
受け入れ基準は、例えば、3組における各刺激の分析、最も高い濃度のGAによる誘導よりも高いか、またはそれと同等である陽性対照ConAによる標的遺伝子の誘導、培地対照の2倍未満である陰性対照MBPによる標的遺伝子の誘導、および検出可能レベル未満であるNTC(鋳型なしの対照)対照の増幅を含んでもよい。実施形態において、標的遺伝子に関するPCR実行が上記の受け入れ基準を満たさない場合、特定の実行を反復する。
【0091】
本発明の方法においては、応答バイオマーカーmRNAを測定して、GAの試験ロットの効力の指示を提供する。GAの試験ロットの効力は、既知の、または適当なGA作用機構と関連する応答を行うその能力によって表される。T細胞のGA刺激によるT細胞サイトカイン発現の特異的誘導はGA試験ロット効力の指示因子として役立ち得るということになる。実施形態において、応答バイオマーカーmRNAは、バイオマーカー遺伝子から転写されるRNA種である。実施形態において、測定される応答バイオマーカーmRNAは、バイオマーカータンパク質をコードする。実施形態において、検出方法は、バイオマーカータンパク質をコードする遺伝子から転写されるmRNA転写物の任意の所与の部分を測定する。実施形態においては、測定を、定量可能なシグナルを生成するための好適なmRNA転写物の任意の部分にハイブリダイズするプライマーまたはプローブを用いる核酸増幅または当業界で公知の他の検出方法により実行する。
【0092】
GA刺激時間は重要である。一般に、バイオマーカーmRNAレベルにおける、容易に検出可能であり、再現性が高い増加または減少が観察される時間枠を選択する。細胞とGAとのインキュベーションに対する応答を測定するための、刺激の開始後の最適時間は、特定の応答バイオマーカーmRNAの発現プロファイルに基づいて変化することが予想される。ある特定のバイオマーカーmRNAの発現に対する刺激の効果は、インキュベーション時間と共に徐々に減少することが観察され(実施例を参照されたい)、従って、より後の時点は有用ではない可能性がある。
【0093】
本発明の方法の実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、GA刺激を開始した後約24時間前に測定する。本発明の方法の実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、GA刺激を開始した後約23、約22、約21、または約20時間前に測定する。
【0094】
本発明の方法の実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約4時間〜約6時間で測定する。本発明の方法の実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーションの開始後約1時間〜約24時間で測定する。実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約1時間、約1.25時間、約1.5時間、約1.75時間、約2時間、約2.25時間、約2.5時間、約2.75時間、約3時間、約3.25時間、約3.5時間、約3.75時間、約4時間、約4.25時間、約4.5時間、約4.75時間、約5時間、約5.25時間、約5.5時間、約5.75時間、約6時間、約6.25時間、約6.5時間、約6.75時間、約7時間、約7.25時間、約7.5時間、約7.75時間、約8時間、約8.25時間、約8.5時間、約8.75時間、約9時間、約9.25時間、約9.5時間、約9.75時間、約10時間、約10.25時間、約10.5時間、約10.75時間、約11時間、約11.25時間、約11.5時間、約11.75時間、約12時間、約12.5時間、約13時間、約13.5時間、約14時間、約14.5時間、約15時間、約15.5時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間で測定する。
【0095】
実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約2時間〜約16時間、約2時間〜約15時間、約2時間〜約14時間、約2時間〜約13時間、約2時間〜約12時間、約2時間〜約11時間、約2時間〜約10時間、約2時間〜約9時間、約2時間〜約8時間、約2時間〜約7時間、約2時間〜約6時間、約2.5時間〜約16時間、約2.5時間〜約15時間、約2.5時間〜約14時間、約2.5時間〜約13時間、約2.5時間〜約12時間、約2.5時間〜約11時間、約2.5時間〜約10時間、約2.5時間〜約9時間、約2.5時間〜約8時間、約2.5時間〜約7時間、約2.5時間〜約6時間、約2.5時間〜約5.5時間、2.5時間〜約5時間、2.5時間〜約4時間、約3時間〜約16時間、約3時間〜約15時間、約3時間〜約14時間、約3時間〜約13時間、約3時間〜約12時間、約3時間〜約11時間、約3時間〜約10時間、約3時間〜約9時間、約3時間〜約8時間、約3時間〜約7時間、約3時間〜約6時間、約3時間〜約5.5時間、3時間〜約5時間、3時間〜約4時間、約3.5時間〜約16時間、約3.5時間〜約15時間、約3.5時間〜約14時間、約3.5時間〜約13時間、約3.5時間〜約12時間、約3.5時間〜約11時間、約3.5時間〜約10時間、約3.5時間〜約9時間、約3.5時間〜約8時間、約3.5時間〜約7時間、約3.5時間〜約6時間、約3.5時間〜約5.5時間、3.5時間〜約5時間、約4時間〜約16時間、約4時間〜約15時間、約4時間〜約14時間、約4時間〜約13時間、約4時間〜約12時間、約4時間〜約11時間、約4時間〜約10時間、約4時間〜約9時間、約4時間〜約8時間、約4時間〜約7時間、約4時間〜約6時間、約4時間〜約5.5時間、約5時間〜約16時間、約5時間〜約15時間、約5時間〜約14時間、約5時間〜約13時間、約5時間〜約12時間、約5時間〜約11時間、約5時間〜約10時間、約5時間〜約9時間、約5時間〜約8時間、約5時間〜約7時間、約5時間〜約6時間、約6時間〜約16時間、約6時間〜約15時間、約6時間〜約14時間、約6時間〜約13時間、約6時間〜約12時間、約6時間〜約11時間、約6時間〜約10時間、約6時間〜約9時間、約6時間〜約8時間、約6時間〜約7時間、約7時間〜約16時間、約7時間〜約15時間、約7時間〜約14時間、約7時間〜約13時間、約7時間〜約12時間、約7時間〜約11時間、約7時間〜約10時間、約7時間〜約9時間、約7時間〜約8時間、約2時間〜約24時間、約2時間〜約20時間、約2時間〜約18時間、約2時間〜約16時間、約4時間〜約24時間、約4時間〜約20時間、約4時間〜約18時間、約4時間〜約16時間、約6時間〜約24時間、約6時間〜約20時間、約6時間〜約18時間、約6時間〜約16時間、約8時間〜約24時間、約8時間〜約20時間、約8時間〜約18時間、または約8時間〜約16時間で測定する。
【0096】
応答バイオマーカーmRNAパネル
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルを、本発明の方法を用いて測定する。実施形態において、パネル中のmRNAを、例えば、多重PCRにより同時に測定する。
【0097】
実施形態において、本発明は、バイオマーカー種のパネルを含む組成物に関する。
【0098】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、少なくとも2つのmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、2〜50のmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50のmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、2〜50、2〜5、2〜10、2〜12、2〜15、2〜20、2〜25、2〜30、2〜35、2〜40、2〜45、3〜50、3〜5、3〜10、3〜12、3〜15、3〜20、3〜25、3〜30、3〜35、3〜40、3〜45、4〜50、4〜10、4〜12、4〜15、4〜20、4〜25、4〜30、4〜35、4〜40、4〜45、5〜50、5〜10、5〜12、5〜15、5〜20、5〜25、5〜30、5〜35、5〜40、5〜45、6〜50、6〜12、6〜15、6〜20、6〜25、6〜30、6〜35、6〜40、6〜45、7〜50、7〜12、7〜15、7〜20、7〜25、7〜30、7〜35、7〜40、7〜45、8〜50、8〜15、8〜20、8〜25、8〜30、8〜35、8〜40、8〜45、9〜50、9〜15、9〜20、9〜25、9〜30、9〜35、9〜40、9〜45、10〜50、10〜15、10〜20、10〜25、10〜30、10〜35、10〜40、10〜45、12〜50、12〜20、12〜25、12〜30、12〜35、12〜40、12〜45、15〜50、15〜25、15〜30、15〜40、20〜50、20〜25、20〜30、20〜40、25〜50、25〜40、30〜50、または30〜45のmRNA種を含む。
【0099】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、CD25、CD69、CD71、CD86(CD86分子)、CD137、CD154、CD278(ICOS、誘導性T細胞共刺激剤)、CD279、HLA−DR、GATA3(GATA結合タンパク質3)、HLA−DMA(主要組織適合複合体、クラスII、DMアルファ)、HLA−DMB(主要組織適合複合体、クラスII、DMベータ)、IFN−γ(インターフェロンガンマ)、IFN−γR2(インターフェロンガンマ受容体)、IL−2(インターロイキン2)、IL−4(インターロイキン4)、IL−5(インターロイキン5)、IL−6(インターロイキン6)、IL−8(CXCL−8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、CXCL7、IL−10(インターロイキン10)、IL−13(インターロイキン13)、IL−18(インターロイキン18)、IL−12RB1(インターロイキン12受容体、ベータ)、IL−17A(インターロイキン17A)、IL−17F(インターロイキン17F)、IL−18R1(インターロイキン18受容体1)、IL−2RA(インターロイキン2受容体、アルファ2)、IL−2RG(インターロイキン2受容体、ガンマ)、IL4−R(インターロイキン4受容体)、IL−6R(インターロイキン6受容体)、IL−21(インターロイキン21)、IL−22(インターロイキン22)、IL−1β(インターロイキン1−ベータ)、TBX21(T−box 21)、TGFBR2(トランスフォーミング増殖因子、ベータ受容体II)、TNF(腫瘍壊死因子、TNF−α)、TNF−β(LT)、TGF−β、FOXP3(フォークヘッドボックスP3)、またはIL−10RB(インターロイキン10受容体、ベータ)をコードする遺伝子からそれぞれ転写される、少なくとも2つのmRNA種を含む。これらの遺伝子の発現を、購入可能なサービス、試薬および/またはキット、例えば、Mouse WG−6 v2.0 Expression BeadChip Kit(Illumina,Inc.,San Diego,CA)を用いて評価することができる。
【0100】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、またはIL−17、IL−21、IL−22、IFN−γ、TNF−α(TNF)、TNF−β(LT)、TGF−β、およびIL−1bから選択されるサイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、CD69、CD25、CD71、CD137、CD154、CD278、CD279、およびHLA−DRから選択される活性化マーカーまたはサイトカイン受容体をコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−8(CXCL8)、RANTES(CCL5)、CCL1、CXCL4、およびCXCL7から選択されるケモカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、Th1関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるmRNA種、Th2関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるmRNA種、Th17関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるmRNA種、およびTFH関連サイトカインをコードする遺伝子から転写されるmRNA種から選択される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、Th1関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、Th1関連サイトカインは、IFN−γ、IL−2、IL−1β、TNF−α、またはCXCL1である。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、Th2関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、Th1関連サイトカインは、IL−4、IL−5、IL−10、またはIL−13である。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、Th17関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、Th17関連サイトカインは、IL−17またはIL−22である。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、TFH関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、TFH関連サイトカインはIL−21である。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、重要な調節関連サイトカインをコードする遺伝子から転写される少なくとも1つのmRNA種を含む。実施形態において、重要な調節関連サイトカインは、IL−10およびTGF−βから選択される。
【0101】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、TNF−α、CD25、およびIL1−βをコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、IL−22、TNF−α、CD25、およびIL1−βをコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4、IL−13、およびTNF−αをコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。
【0102】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、またはCD25をコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、またはCD25をコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−13、IL−17、IL−22、IFN−γ、およびTNF−αをコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、IL−22、およびTNF−αをコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、およびIFN−γをコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4、IL−5、IL−13、およびIL−17をコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、CD25、IL−4、およびIL−13をコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネルは、IL−4およびIL−13をコードする遺伝子から転写されるmRNA種を含む。
【0103】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネル中のmRNA種を、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約4時間〜約6時間で測定する。
【0104】
実施形態において、バイオマーカーmRNA種のパネル中のmRNA種を、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約6時間で測定する。
【0105】
本発明の方法の実施形態において、応答バイオマーカーmRNA種のパネル中のmRNA種を、GA刺激を開始した後約24時間前に測定する。本発明の方法の実施形態において、応答バイオマーカーmRNA種のパネル中のmRNA種を、GA刺激を開始した後約23、約22、約21、または約20時間前に測定する。
【0106】
本発明の方法の実施形態において、応答バイオマーカーmRNA種のパネル中のmRNA種を、LN細胞と、GA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約4時間〜約6時間で測定する。本発明の方法の実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、LN細胞とGA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーションの開始後約1時間〜約24時間で測定する。実施形態において、GA応答バイオマーカーmRNAを、LN細胞とGA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約1時間、約1.25時間、約1.5時間、約1.75時間、約2時間、約2.25時間、約2.5時間、約2.75時間、約3時間、約3.25時間、約3.5時間、約3.75時間、約4時間、約4.25時間、約4.5時間、約4.75時間、約5時間、約5.25時間、約5.5時間、約5.75時間、約6時間、約6.25時間、約6.5時間、約6.75時間、約7時間、約7.25時間、約7.5時間、約7.75時間、約8時間、約8.25時間、約8.5時間、約8.75時間、約9時間、約9.25時間、約9.5時間、約9.75時間、約10時間、約10.25時間、約10.5時間、約10.75時間、約11時間、約11.25時間、約11.5時間、約11.75時間、約12時間、約12.5時間、約13時間、約13.5時間、約14時間、約14.5時間、約15時間、約15.5時間、約16時間、約17時間、約18時間、約19時間、約20時間、約21時間、約22時間、約23時間、または約24時間で測定する。
【0107】
実施形態において、応答バイオマーカーmRNA種のパネル中のmRNA種を、LN細胞とGA試験ロットまたは参照標準ロットとのインキュベーション(刺激)の開始後約2時間〜約16時間、約2時間〜約15時間、約2時間〜約14時間、約2時間〜約13時間、約2時間〜約12時間、約2時間〜約11時間、約2時間〜約10時間、約2時間〜約9時間、約2時間〜約8時間、約2時間〜約7時間、約2時間〜約6時間、約2.5時間〜約16時間、約2.5時間〜約15時間、約2.5時間〜約14時間、約2.5時間〜約13時間、約2.5時間〜約12時間、約2.5時間〜約11時間、約2.5時間〜約10時間、約2.5時間〜約9時間、約2.5時間〜約8時間、約2.5時間〜約7時間、約2.5時間〜約6時間、約2.5時間〜約5.5時間、約2.5時間〜約5時間、約2.5時間〜約4時間、約3時間〜約16時間、約3時間〜約15時間、約3時間〜約14時間、約3時間〜約13時間、約3時間〜約12時間、約3時間〜約11時間、約3時間〜約10時間、約3時間〜約9時間、約3時間〜約8時間、約3時間〜約7時間、約3時間〜約6時間、約3時間〜約5.5時間、約3時間〜約5時間、約3時間〜約4時間、約3.5時間〜約16時間、約3.5時間〜約15時間、約3.5時間〜約14時間、約3.5時間〜約13時間、約3.5時間〜約12時間、約3.5時間〜約11時間、約3.5時間〜約10時間、約3.5時間〜約9時間、約3.5時間〜約8時間、約3.5時間〜約7時間、約3.5時間〜約6時間、約3.5時間〜約5.5時間、約3.5時間〜約5時間、約4時間〜約16時間、約4時間〜約15時間、約4時間〜約14時間、約4時間〜約13時間、約4時間〜約12時間、約4時間〜約11時間、約4時間〜約10時間、約4時間〜約9時間、約4時間〜約8時間、約4時間〜約7時間、約4時間〜約6時間、約4時間〜約5.5時間、約5時間〜約16時間、約5時間〜約15時間、約5時間〜約14時間、約5時間〜約13時間、約5時間〜約12時間、約5時間〜約11時間、約5時間〜約10時間、約5時間〜約9時間、約5時間〜約8時間、約5時間〜約7時間、約5時間〜約6時間、約6時間〜約16時間、約6時間〜約15時間、約6時間〜約14時間、約6時間〜約13時間、約6時間〜約12時間、約6時間〜約11時間、約6時間〜約10時間、約6時間〜約9時間、約6時間〜約8時間、約6時間〜約7時間、約7時間〜約16時間、約7時間〜約15時間、約7時間〜約14時間、約7時間〜約13時間、約7時間〜約12時間、約7時間〜約11時間、約7時間〜約10時間、約7時間〜約9時間、約7時間〜約8時間、約2時間〜約24時間、約2時間〜約20時間、約2時間〜約18時間、約2時間〜約16時間、約4時間〜約24時間、約4時間〜約20時間、約4時間〜約18時間、約4時間〜約16時間、約6時間〜約24時間、約6時間〜約20時間、約6時間〜約18時間、約6時間〜約16時間、約8時間〜約24時間、約8時間〜約20時間、約8時間〜約18時間、または約8時間〜約16時間で測定する。
【0108】
実施形態において、LN細胞を、GAを用いる刺激の後に、またはその際に、タンパク質合成、例えば、シクロヘキシミドの阻害剤で処理する。
【実施例】
【0109】
実施例I.酢酸グラチラマーを用いるチャレンジ後の酢酸グラチラマーで免疫化したマウスに由来するリンパ節細胞中の応答バイオマーカーmRNAを測定する酢酸グラチラマー効力アッセイの開発
GAで免疫化した(SJL/JxBALB/C)F1マウス系統に由来するT細胞のGAチャレンジ後に応答バイオマーカーmRNA発現レベルを測定する酢酸グラチラマー(GA)のための効力アッセイを開発した。免疫化したマウスから得たLN細胞により、GA刺激に応答したサイトカインmRNAレベルの実質的な増加が、刺激後、早くも2時間で、4時間までに確実に示された。
【0110】
アッセイの開発
3つの実験を行って、異なる時点、応答バイオマーカーmRNA、アッセイ形式、および効力アッセイにおける使用のための試薬を評価した。表1は、3つの試験のための実験設計、およびそれぞれ実行された免疫化を示す。
【0111】
【表3】
GA=酢酸グラチラマー (GMA, Mylan Pharmaceuticals, Inc.); CFA=完全Freundアジュバント
【0112】
表1にまとめられた3つの実験のそれぞれについて、メスの(SJL/JxBALB/C)F1ハイブリッド(Jackson Laboratory)マウスを、足蹠注射により、250μgのGMA(Mylan Pharmaceuticals,Inc.)およびCFA(Sigma Aldrich)、またはマンニトールおよびCFA(陰性対照として)を用いて免疫化した。GA溶液を、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水を用いて5mg/mLに希釈した。次いで、良好に乳化するまで、希釈されたGA溶液(5mg/mL)およびCFA(1:1)を混合することにより、用量溶液を調製した。それぞれのマウスは、0.1mL(250μgのGA)の全注射容量を受容した。動物を、0日目に免疫化した。免疫化の後、10日目に頸椎脱臼により免疫化した動物を犠牲にした。腋下および腋窩領域中のリンパ節を、浄化クリーンベンチ中で無菌的に取り出し、約5mLの滅菌RPMI1640培地を含有する滅菌ペトリ皿に移した。LNを約5mLのRPMI培地で3回洗浄し、LNを注射筒プランジャで圧迫することにより、LN細胞を単離した。細胞懸濁液を滅菌50mL円錐チューブに移し、約4℃で10分間、約200xgで遠心分離することにより約40mLのRPMI1640培地中で洗浄し、細胞計数のためにRPMI1640培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を約4℃で10分間、約200xgで遠心分離し、氷冷DCCM−1富化培地中に再懸濁した。LN細胞(2.5x10細胞/cm)を、48穴組織培養プレートのウェル中に播種し、GAまたは対照で刺激した。
【0113】
示された時間にわたって加湿されたCOインキュベータ中、約37℃でインキュベートした後、全RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen、Cat.#74104)を用いて処理された細胞から単離した。細胞をRNA溶解バッファー中で溶解し、Qiagenスピンカラムに移し、洗浄し、DEPC処理された水を用いてカラムからRNAを溶出させた。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems、Cat.#4368814)を用いて、各RNA試料からcDNAを合成した。PCR反応を、TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems、Cat.#4304437)ならびに標的サイトカインおよび参照内部対照のための特異的プライマー/プローブを用いて実行した。マウスサイトカインIL−2(Cat.#4331182;ID Mm00434256_m1)、IL−4(Cat.4331182; ID Mm00445259_m1)、IL−5(Cat.#4331182;ID Mm00439646_m1)、IFN−γ(Cat.#4331182;ID Mm01168134_m1)、IL−10(ID Mm00439614_m1)、およびTNF−α(Mm00443260_g1)のためのプライマー/プローブを、Life Technologiesから入手した。サイトカインmRNAの発現を、リアルタイムPCRシステム(7500、Applied Biosystems)を用いて定量的に分析した。
【0114】
実験1(1A群マウス)において用いられた刺激およびmRNA発現の結果を、表2〜5に示す。1)マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来するGAPDHのための内部プローブに対して正規化すること、および2)サイトカインのmRNA発現レベルを、DCCM1(培地)対照(Beit Haemek Ltd.からのDCCM1;カタログ番号05 0101 1A)中で観察されたレベルで除算することにより、各サイトカインに関する、対照に対する倍数変化を算出した。2時間群についてはMBP処理はなかった(BachemからのMBP;カタログ番号H−1964.0001)。それぞれの評価時間について、DCCM1を試験し、比較すると、すなわち、2時間はDCCM1で2時間、4時間=4時間などを表し、各時点について代表的な対照として役立った。
【0115】
表2は、示された刺激後、2、4、6、および24時間でLN細胞中で検出されたマウスIL−2 mRNAレベルを示す。DCCM1陰性対照と比較したmIL−2 mRNA発現の約5.3倍〜約20.8倍の増加が、これらの時点で観察され、最大の増加は6時間で観察された。24時間までに、増加は2時間で観察されたものよりも下まで低下した。
【0116】
【表4】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0117】
表3は、示された刺激後、2、4、6および24時間でLN細胞中で検出されたマウスIL−4 mRNAレベルを示す。DCCM1対照と比較したmIL−4 mRNA発現の約10倍〜約16.5倍の増加が、これらの時点で観察され、最大の増加は刺激後6時間で観察された。
【0118】
【表5】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0119】
表4は、示された刺激後、2、4、6および24時間でLN細胞中で検出されたマウスIL−5 mRNAレベルを示す。DCCM1対照と比較したmIL−5 mRNA発現の約1.6倍〜約5.1倍の増加が、これらの時点で観察され、最大の増加は刺激後6時間で観察された。24時間までに、増加は2時間で観察されたものの1.9近くにまで低下した。
【0120】
【表6】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0121】
表5は、示された刺激後、2、4、6および24時間でLN細胞中で検出されたマウスIFN−γ mRNAレベルを示す。DCCM1対照と比較したIFN−γ発現の約1.3倍〜約4.6倍の増加が、これらの時点で観察された。6時間で、増加の規模は安定することが観察された。
【0122】
時間経過試験中の試料から単離した全RNAを用いて、mIL−10およびmTNF−αに由来するmRNA発現のレベルも測定した。結果は、GAを用いる刺激後、LN細胞中のmRNAレベルの有意な増加を示さなかった(データは示さず)。刺激後6時間および24時間の両方でのモック処理対照(DCCM1)LN細胞中のものと比較した、GAで処理されたLN細胞中のmRNAレベルの倍数変化は、約1以下であった。
【0123】
【表7】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0124】
実験1について用いられたのと同様の条件下で実行された、実験2(2A群マウスを用いる;設計については表1を参照されたい)において、46穴および98穴プレート形式を比較した(データは示さず)。mIL−2およびmIL−4 mRNAのレベルを、GA(10μg/ml)、MBP(10μg/ml)、およびConA(2.5μg/ml)を用いる刺激後4時間および6時間の両方で、46穴プレート形式(RNeasy Mini Kit、Qiagen)、および98穴プレート形式(SV96 Total RNA Isolation System、Promega)中で測定し、DCCM1対照と比較した。GAで処理された試料中、4時間でのIL−2発現は、それぞれ、48穴形式で対照の16.3倍、および96穴形式で29.5倍で観察され、6時間では、それぞれ、48穴形式で対照の21.0倍、および96穴形式で41.7倍であった。GAで処理された試料中、4時間でのIL−4発現は、それぞれ、48穴形式で対照の8.5倍、および96穴形式で8.0倍で観察され、6時間では、それぞれ、48穴形式で対照の14.0倍、および96穴形式で16.5倍であった。
【0125】
実験3(3A群および4A群のマウス;設計については表1を参照されたい)において、様々な濃度のGAで刺激したLN細胞中で、mIL−2 mRNAを測定した。表6は、実験3の結果を示す。この試験は、第2のロットのGA、Cop(Copaxone、Teva Pharmaceuticals USA,Inc.、発売された製品)で刺激した試料を含んでいた。Cop試料セットにより、サイトカイン生成に対する、異なるロットのGAで免疫化および刺激する効果の比較が可能になった。
【0126】
【表8】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.);SD=標準偏差。
*免疫されていない動物
【0127】
表6は、示された刺激後6時間でLN細胞中で検出されたmIL−2 mRNAレベルを示す。前述のように、1)マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来するGAPDHのための内部プローブに対して正規化すること、および2)サイトカインのmRNA発現レベルを、DCCM1対照のGA刺激に応答して観察されたレベルで除算することにより、対照に対する倍数変化を算出した。実験3については、96穴プレート形式を使用し、RNA単離を、SV96 Total RNA Isolation System(Promega)を用いて実行した。3A群および4A群の免疫化を、表1に記載する。図1Aおよび図1Bは、実験3で検出されたmIL−2 mRNAの発現レベルを比較するグラフである(表6に記載)。mIL−2 mRNAを、CopおよびGA(Mylan GMA)により同等に刺激した。Y軸:mIL−2の線形mRNA倍数変化。X軸:log CopおよびGA(Mylan GMA)濃度値。データセットに関する最良適合を、対数モデルを用いて実施した。全濃度を用いて回帰を実施した場合、勾配値はそれぞれ、GA(Mylan GMA)について6.779、およびCop処理された試料について5.6834であった。5つの濃度(1〜15μg/mL)を用いて回帰を実施した場合、勾配値はそれぞれ、GA(Mylan GMA)について6.214、およびCop処理された試料について5.962であった。図1Aおよび図1B中のグラフは、第1のロットのGAを免疫化のために用いた場合、第1のロットまたは第2のロットのGAのいずれかの濃度を増加させることにより、処理された細胞からのIL−2 mRNAが、刺激と共に用量依存的様式で増加したことを示す。
【0128】
他の実験により、処理された細胞に由来する分泌IL−2が、第1のロットのGA(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.)および第2のロットのGA(Copaxone、Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)の濃度の増加と共に用量依存的様式で増加することが示された(データは示さず)。この用量依存的応答は、Copaxone(登録商標)またはMylan GMAを免疫化抗原として用いたかどうかに関係なく、試験化合物と参照化合物の両方について一致していた。
【0129】
第2のシリーズの実験において、10μg/mLのGAで刺激した後、4時間および6時間で、LN細胞中でのmIL−2、mIL−4、mIL−5、mIL−10およびmIFN−γ mRNAの発現を評価した。この結果は、GAで免疫化したマウスに由来するLN細胞のGA刺激が、サイトカインmRNAレベルの特異的増加を引き起こすことを示している。実験設計を表7に示す。
【0130】
【表9】
NA=適用せず;GA=酢酸グラチラマー;MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照)
【0131】
1B群の動物は、250μgのGAおよびCFA、またはマンニトールおよびCFA(陰性対照として)のいずれかで足蹠注射により免疫化したメスの(SJL/JxBALB/C)F1ハイブリッド(Jackson Laboratory)マウスであった。用量溶液を、希釈されたGA溶液(5mg/mL)およびCFA(1:1)を混合することにより調製した。それぞれのマウスは、1mL(250μgのGA)の全注射容量を受容した。動物を、0日目に免疫化した。免疫化した動物を、免疫化後10日目に頸椎脱臼により犠牲にした。免疫化したマウスに由来するリンパ節を取り出し、単離した。LN細胞(2.5x10細胞/cm)を、GAを用いる刺激のために48穴組織培養プレートのウェル中に播種した。
【0132】
全RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen、Cat.#74104)を用いて、処理された細胞から単離した。細胞をRNA溶解バッファー中で溶解し、Qiagenスピンカラムに移し、洗浄し、DEPC処理された水を用いてカラムからRNAを溶出させた。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems、Cat.#4368814)を用いて、それぞれのRNA試料からcDNAを合成した。TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems、Cat.#4304437)ならびに標的サイトカインおよび参照内部対照のための特異的プライマー/プローブを用いて、PCR反応を実行した。
【0133】
リアルタイムPCRシステム(7500、Applied Biosytems)を用いて、サイトカインmRNAの発現を4時間および6時間後に定量的に分析した。
【0134】
表8〜12は、1B群のマウスのために用いられた刺激(表7に記載)、および得られたmRNA発現の結果を示す。1)マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来する18S RNAまたはGAPDH mRNAのための内部プローブに対して正規化すること、および2)サイトカインのmRNA発現レベルを、同じハウスキーピング遺伝子mRNAに対して正規化されたDCCM1(培養培地)対照に応答して観察されたレベルで除算することにより、各サイトカインに関する、対照に対する倍数変化を算出した。
【0135】
表8は、示された刺激後4時間および6時間でLN細胞中で検出されたmIL−2 mRNAレベルを示す。GAで免疫化したマウス(1B群)に由来するGA刺激細胞中のmIL−2 mRNAレベルは、これらの時点でDCCM−1で刺激した対照と比較して少なくとも10倍増加した。GA刺激は、マンニトール+CFAで免疫化した対照マウス(2B群)に由来する細胞中で検出されたmIL−2 mRNAの実質的な増加をもたらさなかった。さらに、mIL−2 mRNAの発現は、ConA陽性対照細胞中では実質的に増加したが、MBP陰性対照細胞中では増加しなかった。mIL−2 mRNA発現のより大きな増加が、6時間よりも4時間においてGA刺激細胞中で観察された。内部対照(参照遺伝子)は18S rRNAであった。
【0136】
【表10】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー;SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0137】
表9は、示された刺激後4時間および6時間でLN細胞中で検出されたmIL−4 mRNAレベルを示す。GAで免疫化したマウス(1B群)に由来するGA刺激細胞中のmIL−4 mRNAレベルは、これらの時点でDCCM−1で刺激した対照と比較して少なくとも8倍増加した。GA刺激は、マンニトール+CFAで免疫化した対照マウス(2B群)に由来する細胞中で検出されたmIL−4 mRNAの実質的な増加をもたらさなかった。さらに、mIL−4 mRNAの発現は、ConA陽性対照細胞中では実質的に増加したが、MBP陰性対照細胞中では増加しなかった。内部対照(参照遺伝子)は18S rRNAであった。
【0138】
【表11】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー;SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0139】
表10は、示された刺激後4時間および6時間でLN細胞中で検出されたmIL−5 mRNAレベルを示す。GAで免疫化したマウス(1B群)に由来するGA刺激細胞中のmIL−5 mRNAレベルは、これらの時点でDCCM−1で刺激した対照と比較して少なくとも4倍増加した。GA刺激は、マンニトール+CFAで免疫化した対照マウス(2B群)に由来する細胞中で検出されたmIL−5 mRNAの実質的な増加をもたらさなかった。さらに、mIL−5 mRNAの発現は、ConA陽性対照細胞中では実質的に増加したが、MBP陰性対照細胞中では増加しなかった。この実験におけるデータは、参照遺伝子に対して正規化しなかった。
【0140】
【表12】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー;SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0141】
表11は、示された刺激後4時間および6時間でLN細胞中で検出されたmIL−10 mRNAレベルを示す。GAで免疫化したマウス(1B群)に由来するGA刺激細胞中のmIL−10 mRNAレベルは、これらの時点でDCCM−1で刺激した対照と比較して実質的に増加しなかった。内部対照(参照遺伝子)はGAPDHであった。
【0142】
【表13】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー;SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0143】
表12は、示された刺激後4時間および6時間でLN細胞中で検出されたmIFN−γ mRNAレベルを示す。GAで免疫化したマウス(1B群)に由来するGA刺激細胞中のmIFN−γ mRNAレベルは、これらの時点でDCCM−1で刺激した対照と比較して少なくとも約2倍および約7倍も増加した。GA刺激は、マンニトール+CFAで免疫化した対照マウス(2B群)に由来する細胞中で検出されたmIFN−γ mRNAの実質的な増加をもたらさなかった。さらに、mIFN−γ mRNAの発現は、ConA陽性対照細胞中では増加したが、MBP陰性対照細胞中では増加しなかった。内部対照(参照遺伝子)はGAPDHであった。
【0144】
【表14】
省略:MBP=ミエリン塩基性タンパク質(陰性対照);ConA=コンカナバリンA(陽性対照);GA=酢酸グラチラマー;SD=標準偏差;NA=適用せず(n<3)。
【0145】
図2は、表8〜12に提示されたサイトカインmRNA発現の増加の概要を提供する。
【0146】
実施例II.酢酸グラチラマーを用いる刺激後の3つの系統のマウスに由来するT細胞によるサイトカインの分泌
本実施例は、GA効力アッセイのためのGA特異的T細胞の取得における使用のための3つのさらなるマウス系統を評価するために実施された実験を記載する。エクスビボでのGA刺激に応答する、CD−1、BALB/cByJ、およびC57BL/10Jマウスから単離したGA特異的T細胞による、9つのサイトカイン(IL−1β、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−12、IFN−γ、TNF−α、およびCXCL1、KCとも呼ばれる)の分泌の動力学を、同時に試験した。足底内注射により免疫化したLN細胞および下肢注射により免疫化した細胞中でサイトカイン分泌を比較した。
【0147】
表13は、実験設計を示す。
【0148】
【表15】
省略:GA=酢酸グラチラマー;CFA=完全Freundアジュバント (1 mg/ml)
【0149】
メスのCD−1、BALB/cByJおよびC57BL/10Jマウス(各14匹、それぞれ、Hilltop Laboratories、Jackson Laboratory、およびJackson Laboratoryから)を、表13に示したように、GA(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.、DPBS中で調製)またはマンニトール対照で、足底内または下肢注射により免疫化した。8週齢の動物を、27−G、1/2インチ針を有する1mL注射筒を用いて、4つの足蹠中への注射により免疫化した。足底内注射のために、各マウスは、0.1mLの全注射容量を受容した(それぞれの前足蹠中に約10μLおよびそれぞれの後足蹠中に40μL)。下肢への皮下注射のために、各マウスは、0.1mLの全注射容量を受容した(それぞれの前下肢中に約25μLおよびそれぞれの下肢の膝に25μL)。
【0150】
免疫化の10日後、免疫化した動物を頸椎脱臼により犠牲にした。免疫化したマウスに由来する腋下および腋窩領域中のリンパ節を、5mLの氷冷滅菌RPMI−1640培地を含有するペトリ皿に群毎に除去およびプールした。無傷のリンパ節を5.0mLの氷冷滅菌RPMI1640培地中で3回洗浄した。滅菌注射筒のプランジャ端部を用いてLNを圧迫することにより、LN細胞を単離した。細胞懸濁液を最初に100μmナイロン細胞ストレーナーに通過させた後、40mLの氷冷RPMI−1640培地で1回洗浄した。4℃で10分間、約200xgで遠心分離した後、細胞計数のために細胞ペレットを40mLのRPMI−1640培地中に再懸濁した。トリパンブルー色素排除法を用いて、懸濁液中の生細胞の細胞密度を決定した。細胞計数後、LN細胞を4℃で10分間、約200xgで遠心分離し、DCCM−1富化培地(DCCM−1培地中の2mM GlutaMax、1x抗生物質−抗真菌剤、55μM 2−メルカプトエタノール、1mM MEMピルビン酸ナトリウム溶液、および100μM MEM非必須アミノ酸溶液、Beit Haemek Ltd.、カタログ番号05 010 1A)中に、1.0x10細胞/mLの細胞密度で再懸濁した。LN細胞を、薬物刺激のために24穴組織培養プレート中に播種した。
【0151】
GAで免疫化した一次LN細胞(0.5mL、5x10細胞/ウェル)の各群(1、2、3、5、7および8群)を、4つの濃度のGA溶液(免疫化に用いられたMylan GMAの同じバッチ、0.5mL、最終濃度0.5、1.0、2.5および10μg/mL)で刺激した。マンニトールで免疫化した動物に由来するLN細胞の各群(3、6および9群)を、同じ手順を用いて2つのGA希釈試料(0.5および1.0μg/mL、または2.5および10μg/mLのGA)で処理した。
【0152】
加湿された5%COインキュベータ中、37℃で21時間インキュベートした後、培養培地を指定の時点で収獲した。細胞破片を、4℃で10分間、約200xgで遠心分離することにより除去した。処理された細胞により分泌されたサイトカインを、Th1サイトカイン(IFN−γ、IL−2、IL−12、IL−1β、TNF−α、CXCL1)およびTh2サイトカイン(IL−4、IL−5およびIL−10)を検出するマウスTH1/TH2 9−Plex Tissue Culture Kit(Meso Scale Discovery;カタログ番号K15013B−2、ロット番号K0032839)を用いるELISAにより回収日に決定した。IFN−γについては、培養培地も、マウスIFN−γ Tissue Culture Kit(Meso Scale Discovery;カタログ番号K152AEB−2、ロット番号K0033074)を用いて45時間でアッセイした。
【0153】
陽性対照としての非特異的T細胞刺激因子であるコンカナバリンA(ConA)、および陰性対照としての、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)によるLN細胞の刺激を含めて、アッセイ性能をモニタリングするために対照試料を調製した。陽性対照については、0.5mLのLN細胞(5x10細胞/ウェル)を、0.5mLのConA(5μg/mL)で処理した。陰性対照については、0.5mLのLN細胞(5x10細胞/ウェル)を、0.5mLのMBP(20μg/mL)で処理した。モック刺激(DCCM1富化培地)したLN細胞を用いて、サイトカインのバックグラウンドレベルをモニタリングした。
【0154】
サイトカインアッセイのために、較正標準または試料を、MULTI−SPOTまたはSINGLE−SPOTプレート中でインキュベートしたところ、各サイトカインはその対応する捕捉抗体に結合した。全被験試料について2回行った。その異なるスポット上の各サイトカインの量を、MSD SULFO−TAG(商標)試薬で標識されたサイトカイン特異的検出抗体を用いて定量化した。各ウェルに由来する各スポット上の固定されたSULFO−TAG(商標)標識複合体からの電気化学発光シグナルを、被験試料中の捕捉されたサイトカインの量に直接比例するシグナルを生成する、MSD SECTOR Imager 6000により捕捉した。被験試料中のサイトカインのレベルを、MSDキットと共に提供される試薬を用いて既知の濃度の較正標準を有する較正曲線からの内挿により誘導した。キットを、製造業者のプロトコールに従って用いた。
【0155】
表14は、試験した3つのマウス系統のそれぞれに由来するGAで刺激したLN細胞により分泌されたサイトカインを示す。データを、処理された細胞培地中のサイトカイン濃度と、対照DCCM1培地との応答比として表す。
【0156】
【表16】
【0157】
【数1】
【0158】
表14に示されるように、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10およびIFN−γの分泌は、GA刺激にとって特異的であると考えられ、GA濃度と共に用量依存的増加を示した。これらのサイトカインのレベルは、GAで免疫化した動物に由来するGA刺激LN細胞において、刺激しない場合の同細胞におけるものよりも高かった。さらに、GA処理した細胞中のサイトカインの分泌は、マンニトールで免疫化した対照動物から単離した細胞中では観察されなかった。
【0159】
GA刺激に応答してIL−2、IL−4、IL−5およびIL−10(4〜6群)を分泌したBALB/cByJマウスに由来するLN細胞は、CD−1マウス(1〜3群)に由来するLN細胞中での分泌と類似するか、またはそれよりも高かった。IFN−γ分泌はGA刺激の約21時間後ではBALB/cByJ細胞中よりもCD−1 LN細胞中でより高かったが、GAインキュベーションの45h後では2つの系統に由来するLN細胞間で類似していた。GA刺激後のIL−12、TNF−αおよびKC分泌の用量応答は、3つのマウス系統のいずれの由来する細胞についても検出されなかった。IL−1βの用量応答は、細胞を足底内注射によりプライミングした場合、BALB/cByJおよびCD−1マウス系統に由来するLN細胞中で検出された。
【0160】
IL−4は、BALB/cByJ細胞中、用量依存的様式でGAに応答して分泌された。GAに対する応答は、足底内注射によりプライミングされた細胞と下肢注射によりプライミングされた細胞において類似していた。
【0161】
IL−2は、3つのマウス系統のそれぞれに由来するLN細胞中、用量依存的様式でGAに応答して分泌された。最も高いIL−2応答は、BALB/cByJ細胞中で検出された。下肢GA注射によりプライミングされた動物に由来するBALB/cByJ細胞は、足底内注射によりプライミングされた細胞よりも高い応答を有すると考えられた。C57BL/10Jマウスにおいては、GA刺激に対するIL−2応答は、足底内注射によりプライミングされたLN細胞と下肢注射によりプライミングされた細胞において類似していた。
【0162】
IFN−γは、3つのマウス系統のそれぞれに由来するLN細胞中、用量依存的様式でGAに応答して分泌された。一般に、足底内GA注射によりプライミングされた細胞は、3つ全ての系統において下肢注射によりプライミングされた細胞と類似するか、またはそれより高い応答を有すると考えられた。
【0163】
IL−5は、BALB/cByJ細胞およびCD1細胞中、用量依存的様式でGAに応答して分泌された。GAに対するIL−5応答は用量依存的であり、下肢注射によりプライミングされた細胞よりも足底内注射によりプライミングされた細胞において高かった。
【0164】
IL−10は、BALB/cByJ細胞およびCD1細胞中、用量依存的様式でGAに応答して分泌された。GAに対するIL−10応答は用量依存的であり、下肢注射によりプライミングされた細胞よりも足底内注射によりプライミングされた細胞において高かった。
【0165】
実施例III.酢酸グラチラマーでチャレンジした後に、酢酸グラチラマーで免疫化したCD−1、BALB/cByJ、およびSJL/Jマウス系統に由来するリンパ節細胞中の応答バイオマーカーmRNAを測定する酢酸グラチラマー効力アッセイ
GAで免疫化したCD−1、BALB/cByJ、およびSJL/Jマウス系統(それぞれ、Hilltop Laboratory、Jackson Laboratory、およびJackson Laboratoryから)に由来するT細胞を、本発明のGA効力アッセイにおいて用いた。GAで免疫化したマウスから得たLN細胞は、刺激後6時間で、GA刺激に応答してサイトカインmRNAレベルの実質的な増加を示した。
【0166】
表15は、3つの系統のそれぞれの免疫化のための実験設計を示す。0日目に、マウスを250μgのGA(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.)およびCFAで免疫化した。GA溶液(20mg/mL)を、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水を用いて5mg/mLに希釈した。投与製剤は、良好に乳化するまで混合された、等量の希釈されたGA溶液(5mg/mL)とCFA溶液とからなっていた。動物を計量し、群に割り当てた。動物に、4つの足蹠への注射により投与した。動物1匹あたりの注射容量は、0.1mL(それぞれの前足蹠に約10μL、およびそれぞれの後足蹠に40μL)であった。
【0167】
【表17】
省略:F=メス;GA=酢酸グラチラマー;CFA=完全Freundアジュバント
【0168】
表16は、免疫化したマウスに由来するLN細胞の刺激のための実験設計を示す。免疫化後10日目に、免疫化した動物を頸椎脱臼により安楽死させた。リンパ節細胞を動物から単離し、表16に示されるようにミエリン塩基性タンパク質(MBP、陰性対照)、コンカナバリンA(ConA、陽性対照)またはGAで処理した。腋下および腋窩領域中のリンパ節を、浄化クリーンベンチ中で無菌的に取り出した。リンパ節を、約5mLの滅菌RPMI1640培地を含有する滅菌ペトリ皿に移した。次いで、LNを約5mLのRPMI培地で3回洗浄し、注射筒プランジャを用いてLNを圧迫することにより単離した。細胞懸濁液を滅菌50mL円錐チューブに移し、約4℃で10分間、約200xgで遠心分離することにより約40mLのRPMI培地中で洗浄し、細胞計数のためにRPMI1640培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を約4℃で10分間、約200xgで遠心分離し、氷冷DCCM−1富化培地中に再懸濁した。細胞を96穴組織培養プレート中に播種した。
【0169】
【表18】
【0170】
GAで免疫化した動物から単離したLN細胞を、表16および表17に示した濃度のGA(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.)で刺激した。LN細胞を2.5μg/mLのコンカナバリンA(ConA、非特異的T細胞刺激剤)で処理することにより、陽性対照を調製した。ミエリン塩基性タンパク質(MBP、10μg/mL)およびDCCM−1富化培地は、陰性対照として役立った。全群に由来する細胞をそれぞれ、同じGAロットで刺激した。それぞれの反応を3組設定した。
【0171】
加湿されたCOインキュベータ中、約37℃で6時間インキュベートした後、全RNA単離のために細胞を溶解した。製造業者のプロトコールに従ってSV96 Total RNA Isolation System(Promega、Cat.#Z3500)を用いて、処理されたLN細胞から全RNAを単離した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、RNA溶解バッファー中に溶解した。溶解物をSV96結合プレートのウェルに移した。試料をRNA洗浄溶液で洗浄し、DNaseで処理した。全RNAを、結合プレートからヌクレアーゼ非含有水を用いて溶出させた。
【0172】
製造業者のプロトコール(Life Technologies)に従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies、以前のApplied Biosystems、Cat.#4368814)を用いて、それぞれのRNA試料からcDNAを3回合成した。逆転写(RT)を、Thermal Cycler(2720、Life Technologies)により、以下のように実施した。
【0173】
【表19】
【0174】
逆転写酵素反応が完了した後、cDNA試料をリアルタイムPCRのために直接用いて、刺激された細胞により生成される応答バイオマーカーmRNAレベルを測定した。応答バイオマーカーmRNAレベルを測定するために、Life Technologiesから入手したTaqMan Universal PCR Master Mix(Cat.#4304437)ならびにマウスサイトカインIL−2(Cat.#4331182;ID Mm00434256_m1)、IL−4(Cat.#4331182;ID Mm00445259_m1)、IL−5(Cat.#4331182;ID Mm00439646_m1)、IL−10(Cat.#4331182;ID Mm00439614_m1)、IL−13(Cat.#4331182;ID Mm00434204_m1)、IFN−γ(Cat.#4331182;ID Mm01168134_m1)およびTNF−α(Cat.#4331182;ID Mm00443260_g1)のためのプライマー/プローブを用いた。参照遺伝子(内部対照)であるマウスグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH、Cat.#4352339E)も、Life Technologiesから入手した。標的遺伝子のための全てのプローブは、FAM染料を含有し、内部対照のためのプローブはVIC(登録商標)/MGB染料を含有していた。試料を調製し、リアルタイムPCRシステム(7500、Life Technologies)を用いて96穴プレート中で実行した。このシステムは、PCR反応中に蛍光放出の増加を連続的に測定することにより、PCR生成物形成の直接的検出を可能にする。相対的定量法を用いて、未処理対照(DCCM−1富化培地処理)試料と比較した、GA処理した試料中のマウスIL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IFN−γおよびTNF−α発現の変化を分析した。リアルタイムPCRプログラムは、以下の通りであった。
【0175】
【表20】
【0176】
マウスサイトカインアンプリコン(IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、mIFN−γおよびTNF−α)のレベルを、同じ試料に由来する内部プローブレベル(GAPDH)に対して正規化した。以下の式を用いて、対照試料と比較した、GA刺激に応答した相対的増加を算出した。
【0177】
ΔC=CT_標的−CT_参照
【0178】
ΔΔC=ΔCT_処理−CT_VC
【0179】
【数2】
【0180】
式中、
標的=マウスIL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IFN−γおよびTNF−α
参照=GAPDH
処理=GA、ConAまたはMBPを用いる刺激
VC(媒体対照)=DCCM−1富化培地とのインキュベーションである。
【0181】
平均値の算出:
【0182】
【数3】
【0183】
標準偏差:
【0184】
【数4】
【0185】
式中、X=個々のデータであり、n=データ点の数である。
【0186】
変動係数(CV、精度):
【0187】
【数5】
【0188】
結果を、表17にまとめる。
【0189】
【表21】
【0190】
【数6】
【0191】
表17中のデータを、図3〜図13にグラフ化する。mRNAレベルに対するGA刺激濃度の用量依存的効果が、3つ全部のマウス系統に由来するLN細胞中で多くの応答バイオマーカーmRNAについて観察された。
【0192】
実施例IV.GAで免疫化したマウスに由来するリンパ節細胞中でのGAを用いる刺激後のサイトカインmRNAレベルの定量的測定のためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の検証
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を、GA刺激後のSJL/Jマウスリンパ節細胞中でのサイトカインのmRNAレベルの定量的測定のために検証した。
【0193】
1バッチのGA(Mylan GMA)を用いて、3つの実験を行った。37℃で6時間、6つの濃度(0.3〜20μg/mL)のGAと共にインキュベートすることにより、一次LN細胞を刺激した。全RNAを、GAまたは対照で刺激したLN細胞から単離した。cDNAをRNAから合成し、7つのマウスサイトカイン、IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、インターフェロン(IFN)−γおよび腫瘍壊死因子(TNF)−αのmRNAレベルを、リアルタイムPCR法により定量的に測定した。
【0194】
5つのサイトカイン、IL−2、IL−4、IL−5、IL−13およびIFN−γを、GA刺激に応答するGAで免疫化したマウスに由来するLN細胞中、mRNAレベルで誘導した。mRNAのレベルは用量依存的様式で増加した。ConA刺激(陽性対照)後のIL−2のmRNAレベルの増加は、最も高い濃度のGA(20μg/mL)刺激により誘導された増加よりも大きかった。陰性対照MBPによるサイトカインのmRNAレベルの有意な誘導はなかった。NTC(鋳型なしの対照)試料の増幅は、検出可能レベルよりも下であった。表18は、実験設計を示す。
【0195】
【表22】
【0196】
8〜9週齢のメスのSJL/Jマウスを、27−G、1/2インチ針を有する1mL注射筒を用いて4つの足蹠への注射により免疫化した。それぞれのマウスは、CFA中で乳化された全注射容量0.1mLのGMAを受容した(それぞれの前足蹠に約10μLおよびそれぞれの後足蹠に40μL)。動物を、0日目に免疫化した。注射後、動物をそのケージに戻し入れ、ケージあたり6匹以下で飼育した。
【0197】
免疫化の後10日目に頸椎脱臼により免疫化した動物を犠牲にした。免疫化したマウスに由来する腋下および腋窩領域中のリンパ節を取り出し、プールし、5mLの氷冷滅菌RPMI−1640培地を含有する滅菌ペトリ皿に入れた。無傷のリンパ節を、5.0mLの滅菌RPMI1640培地中で3回洗浄し、滅菌注射筒プランジャを用いてLNを圧迫することにより、LN細胞を単離した。細胞懸濁液を最初に100μmのナイロン細胞ストレーナーに通過させた後、40mLの氷冷RPMI−1640培地で1回洗浄した。4℃で10分間、約200xgで遠心分離した後、2回目の洗浄のために細胞ペレットを40mLのRPMI−1640培地中に再懸濁した。4℃で10分間、約200xgで遠心分離した後、細胞計数のために細胞ペレットを40mLのDCCM−1培地中に再懸濁した。トリパンブルー色素排除法を用いて、懸濁液中の生細胞の細胞密度を決定した。細胞計数後、LN細胞を7.5x10細胞/mLの密度でDCCM−1富化培地中に懸濁した。LN細胞(0.12mL)を、96穴組織培養プレートの各ウェルに播種した。
【0198】
GA(Mylan GMA)の希釈液を、希釈剤としてDCCM−1富化培地を用いて調製した。GA希釈液(0.12mL)を、96穴組織培養プレートの割り当てられたウェルに添加した。免疫化した動物から単離した同量のLN細胞(0.12mL)を、割り当てられたウェルに添加した。LN細胞を、それぞれ、2.5μg/mLのConAおよび10μg/mLのMBPで処理することにより、同じアッセイ中で陽性対照と陰性対照を常時実施した。モック刺激プロトコール(DCCM−1富化培地)を用いるLN細胞を用いて、サイトカインのバックグラウンドmRNAレベルをモニタリングした。Mylan GAを用いる刺激を、表19にまとめる。プレートを、加湿された5%COインキュベータ中、37℃で6hインキュベートした。
【0199】
【表23】
【0200】
インキュベーション時間の終わりに、刺激された細胞からの培養培地を吸引により除去し、細胞をQiagenまたはPromegaの溶解バッファーを用いて溶解した。溶解物を、RNAの単離およびcDNA合成のために、RNeasy Miniカラム(Qiagen)またはSV96 Binding Plate(Promega)のウェルに移した。全ての被験試料について3回行った。
【0201】
SV96 Total RNA Isolation System(Promega;カタログ番号Z3505)を、全RNA単離のために用いた。アッセイ手順を、それぞれの製造業者のプロトコールに従って実行した。RNA試料を、使用まで−70℃で保存した。High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Qiagen;カタログ番号4368814)を、cDNAの合成のために用いた。アッセイ手順を、製造業者のプロトコールに従って実行した。
【0202】
用いられたマウスサイトカインプライマー/プローブは、IL−2(Cat.#4331182;ID Mm00434256_m1)、IL−4(Cat.#4331182;ID Mm00445259_m1)、IL−5(Cat.#4331182;ID Mm00439646_m1)、IL−10(Cat.#4331182;ID Mm00439614_m1)、IL−13(Cat.#4331182;ID Mm00434204_m1)、IFN−γ(Cat.#4331182;ID Mm01168134_m1)およびTNF−α(Cat.#4331182;ID Mm00443260_g1)であった。参照遺伝子プライマー/プローブは、マウスGAPDHに関するものであった(Life Technologies、カタログ番号4352339E)。
【0203】
cDNA試料を、TaqMan Universal PCR Master Mix(Life Technologies Cat.#4304437)ならびに標的遺伝子プライマーおよびプローブを含有する割り当てられたウェルに、多チャネルピペットを用いてピペット注入した。プレートを4℃で2分間、2000rpmで遠心分離して、内容物を沈降させ、気泡を除去した。試料を、製造業者の推奨に従ってLife TechnologiesのリアルタイムPCRシステム(以前のApplied Biosystems;モデル番号7500)を用いて96穴プレート中で調製、実行した。参照遺伝子のための混合物を、参照遺伝子プライマーを用いて同じ方法で調製した。
【0204】
相対的定量法を用いて、以下のプログラムを用いた未処理対照(DCCM−1富化処理)試料と比較した、GA処理した試料中のmIL−2、mIL−4、mIL−5、mIL−10、mIL−13、mIFN−γおよびTNF−α発現の変化を分析した。
【0205】
【表24】
【0206】
マウスサイトカインアンプリコンのレベルを、同じ試料に由来する内部プローブレベル(GAPDH)に対して正規化した。以下の式を用いて、対照試料(DCCM1富化試料)と比較したGA刺激に応答した相対的増加を算出した。
【0207】
T_標的とCT_参照の平均値の算出:
【0208】
ここで、標的:IL−2、IL−4、IL−5、IL−10、IL−13、IFN−γおよびTNF−αである。
【0209】
参照:GAPDH。
【0210】
【数7】
【0211】
各平均C値の標準偏差の算出:
【0212】
【数8】
【0213】
式中、SD=CT_標的またはCT_参照のSDであり、X=個々のデータであり、n=データ点の数である。
【0214】
平均C値からのΔC値の算出:
【0215】
ΔC=CT_標的−CT_参照
【0216】
ΔC値の標準偏差の算出:
【0217】
SDΔCT=(SD標的+SD参照1/2
【0218】
式中、Y1/2はYの平方根であり、Y=SD標的+SD参照である。
【0219】
ΔΔC値の算出:
【0220】
ΔΔC=ΔCT_処理−CT_VC
【0221】
式中、処理:GA、ConAまたはMBPと共にインキュベートした。
【0222】
VC(媒体対照):DCCM−1と共にインキュベートした。
【0223】
ΔΔC値の標準偏差の算出:
【0224】
ΔΔC値の標準偏差は、ΔC値の標準偏差と同じである。
【0225】
誘導倍数および誘導範囲の算出:
【0226】
【数9】
【0227】
誘導範囲=2−A〜2−B
【0228】
式中、A=ΔΔC+SDΔΔCTであり、B=ΔΔC−SDΔΔCTである。
【0229】
算出(平均、SDおよび関連する算出)を、特定されない限り、完全浮動小数点算出を用いてMicrosoft Excel(登録商標)Version 2007スプレッドシート内で実施した。表中のいくつかの番号を表示のために丸で囲んだ。これらの算出に基づいて、平均法からの差異率を用いて、外れ値を決定した。平均からの差異率を、各反復C値から平均C値を減算した後、平均C値で除算し、100を乗算することにより算出した。パーセンテージが4.0%(絶対値)以上である場合、反復は外れ値であった。2つの反復のパーセンテージが4.0%以上であり、第3の反復の差異率が0.5%以上であった場合、最大の絶対値を外れ値と指定した。2つの反復のパーセンテージが4.0%以上であり、第3の反復が0.5%未満であった場合、全ての値を算出のために用いた。
【0230】
試料分析を、表20に示される分析実行において完了させた。
【0231】
【表25】
P:通過、F:失敗
a:失敗:陰性対照MBPが受け入れ基準を満たさなかったことに起因する
b:失敗:陽性対照ConAが受け入れ基準を満たさなかったことに起因する
c:以前に失敗したPCR実行のための反復PCR実行
【0232】
マウスIL−2、IL−4および参照遺伝子GAPDHに関する代表的な増幅プロットを作成した。それぞれの閾値を、増幅曲線の対数期において7500ソフトウェアv2.0.6により自動的に設定した。
【0233】
試験した全てのサイトカインに関して低レベルのmRNA発現が、モック刺激したLN細胞(DCCM−1と共にインキュベートした)中で検出された。IL−2、IL−4、IL−5、IL−13およびIFN−γのmRNAレベルは、DCCM−1対照と比較してGAで処理されたLN細胞中で増加し、その増加は用量依存的であり、飽和可能であった。IL−10およびTNF−αのmRNAレベルは弱く、またはSJL/Jマウスにおけるインビトロ(in vitro)でのGA刺激に応答して誘導されなかった。
【0234】
マウスIL−2 mRNA発現
マウスIL−2 mRNAは、3つ全ての実験においてGAで刺激したLN細胞中で誘導された。20μg/mLのGAを用いて刺激した後、IL−2 mRNAの誘導はそれぞれ、実験1において31.7倍、実験2において27.8倍、および実験3において42.0倍であった(表21)。
【0235】
【表26】
(リアルタイムPCRはG1R1_011613_P2、G2R1_012113_P2、G3R1_012313_P2を実行する)
【0236】
マウスIL−4 mRNA発現
マウスIL−4 mRNAは、3つ全ての実験においてGAで刺激したLN細胞中で誘導された。20μg/mLのGAで刺激した後のIL−4 mRNAの誘導はそれぞれ、実験1において41.3倍、実験2において11.8倍、および実験3において27.6倍であった(表22)。
【0237】
【表27】
(リアルタイムPCRはG1R1_011613_P2、G2R1_012113_P2、G3R1_012313_P2を実行する)
【0238】
マウスIL−5 mRNA発現
マウスIL−5 mRNAは、3つ全ての実験においてGAで刺激したLN細胞中で誘導された。20μg/mLのGAを用いる刺激後、それぞれ実験1において5.2倍、実験2において5.3倍、および実験3において15.2倍のIL−5 mRNAの誘導が観察された(表23)。
【0239】
【表28】
(リアルタイムPCRはG1R1_011713_P2、G2R3_012213_P2、G3R3_012313_P2を実行する)
【0240】
マウスIL−10 mRNA発現
マウスIL−10 mRNAの誘導は、全ての実験においてモック刺激した対照と比較してGAによる刺激に応答してLN細胞中で観察されなかった(表24)。
【0241】
【表29】
(リアルタイムPCRはG1R1_011713_P2、G2R3_012213_P2、G3R3_012313_P2を実行する)
【0242】
マウスIL−13 mRNA発現
マウスIL−13 mRNAは、3つ全ての実験においてGAで刺激したLN細胞中で誘導された。20μg/mLを用いる刺激後のIL−13 mRNAの誘導はそれぞれ、実験1について17.6倍、実験2において21.3倍、および実験3において33.9倍であった(表25)。
【0243】
【表30】
(リアルタイムPCRはG1R3_011713_P1、G2R2_012113_P1、G3R2_012313_P1を実行する)
【0244】
マウスIFN−γ mRNA発現
インビトロでのGA刺激に応答してLN細胞中でIFN−γ mRNAの弱い誘導が観察された。3つの実験に由来するLN細胞は、GA刺激に応答して類似するパターンを示した。IFN−γ mRNAの誘導は、2.5〜10μg/mLのGAによる刺激後に2倍以上に達した。しかしながら、20μg/mLのGAによる刺激後では、IFN−γ mRNAの発現レベルは、3つ全ての実験において0.3μg/mLのGA刺激による刺激後に観察されたものと同様のレベルにまで低下した(表26)。
【0245】
【表31】
(リアルタイムPCRはG1R3_011713_P1、G2R2_012113_P1、G3R2_012313_P1を実行する)
【0246】
マウスTNF−α mRNA発現
TNF−α mRNAの誘導は、モック刺激した対照と比較してGAによる刺激後のLN細胞中で観察されなかった(全て2倍未満)(表27)。
【0247】
【表32】
(リアルタイムPCRはG1R4_011813_P1、G2R4_012213_P1、G3R4_012313_P1を実行する)
【0248】
かくして、7つのサイトカインのうちの5つ、IL−2、IL−4、IL−5、IL−13およびIFN−γのmRNAレベルが、GA刺激に応答してLN細胞中で誘導された。IL−10およびTNF−α mRNAの発現は、有意に変化しなかった。NTC(鋳型なしの対照)試料の増幅は、全てのPCR実行について検出可能レベルより下であった。全群に由来するLN細胞を、ConAおよびMBPに対するその応答について試験した。ConAで処理されたLN細胞(2.5μg/mL)に由来する全サイトカインmRNAの発現レベルは、IL−10 mRNA(実験1、表24)およびTNF−α(実験3、表27)について以外は、最も高い濃度(20μg/mL)のGAによる刺激後の発現レベルよりも高かった。MBP処理に応答するサイトカインmRNAの発現レベルは、IL−4(実験1、表22)およびIL−5(実験3、表23)について以外は、全てのPCR実行において2倍以下であった。3つのPCR実行(ConAについてはIL−10、ならびにMBPについてはIL−4およびIL−5)を反復し、ConAまたはMBP処理に対する応答とは関係なく元の実行からの結果と比較して類似する結果が得られた(データは示さず)が、これは、結果とアッセイが一致していることを示唆していた。この試験からの結果は、3つの独立した実験に由来する試験したサイトカインについてユニークなサイトカイン誘導プロファイル(誘導性対非誘導性)および一貫した誘導規模(軽度から有意)を示したが、これは、リアルタイムPCR法がGA刺激後のGAで免疫化したマウスに由来するLN細胞中のサイトカインmRNAレベルの定量的測定にとって、再現性の高い方法であることを示している。
【0249】
結論
高感度定量的リアルタイムPCR法を、インビトロでのGA刺激後のGAで免疫化したマウスに由来するLN細胞中のサイトカインmRNAをプロファイリングし、定量化するために検証した。ハウスキーピング遺伝子としてGAPDHを用いる比較C法により、相対的定量分析を実行した。GAで免疫化したマウスのLN細胞の、様々な濃度のGAによる刺激は、刺激されていないLN細胞中のものと比較した結果、IL−10、TNF−αの誘導はなく、IFN−γを弱く誘導し、IL−5を中程度に誘導し、IL−2、IL−4およびIL−13 mRNAレベルを強固に誘導した。この結果は、この方法がGA刺激に応答したLN細胞中のサイトカインmRNA発現を測定するのに高感度であり、再現性が高く、効率的であることを示している。
【0250】
実施例V.リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いる試験GAおよび参照GAロットによる刺激後のマウスリンパ節細胞中のサイトカインmRNAレベルの定量的測定
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、GAで免疫化したSJL/Jマウスに由来するGAで刺激したLN細胞中のサイトカインmRNAの発現を測定した。2つの異なるハウスキーピング遺伝子、GAPDHおよびβ−アクチンを用いる発現の正規化を試験した。
【0251】
各群は、4つ全ての足蹠に、250μgの全用量の1ロットのGA、またはマンニトールを注射する、およびGAを注射しないことにより免疫化した6匹のメスのSJL/Jマウスからなっていた。3つのCopaxoneバッチおよび3つのGMAバッチを用いて、マウスを免疫化した。CFAを、GAとマンニトールの両方の免疫化に含有させた。免疫化の10日後、免疫化したマウスから単離したLN細胞試料を、ある濃度のCopaxoneロットおよびGMAロットを用いてそれぞれ刺激した。2.5μg/mLのConAで処理されたLN細胞の陽性対照と、10μg/mLのMBPで処理された細胞の陰性対照とを、各群に含有させた。
【0252】
初回の実行においては、サイトカインmRNAレベルをGAPDH mRNAレベルに対して正規化した場合、再現性の欠如が観察された。従って、参照遺伝子としてGAPDHとβ−アクチンの両方を用いて、IL−2、IL−4、IL−5、およびIL−13のレベルを測定するQ−PCR分析を試料に対して反復した。反復された実行に関する実験設計を、表28に示す。
【0253】
【表33】
【0254】
RNA単離および分析手順は、実施例IVに記載のものと同様であった。観察されたマウスIL−2、IL−4、IL−5およびIL−13 mRNAの発現レベルを、以下の表29〜36にまとめる。表30、32、34および36中のデータに示されるように、IL−13以外の全てのサイトカインについて、サイトカインmRNAレベルをGAPDH mRNAに対して正規化した場合、再度、結果の再現性の欠如が観察された。しかしながら、β−アクチンを参照ハウスキーピング遺伝子として用いた場合、COPおよびGMAによる同等の刺激が、分析した各サイトカインmRNAについて観察された。
【0255】
【表34】
【0256】
【表35】
【0257】
【表36】
【0258】
【表37】
【0259】
【表38】
【0260】
【表39】
【0261】
【表40】
【0262】
【表41】
【0263】
結論
ハウスキーピング遺伝子としてのβ−アクチンの使用により、CopaxoneまたはGMAのいずれかで免疫化したマウスから得たリンパ節細胞を用いてCopaxoneのロットをGMAのロットと比較した場合に観察された、様々なサイトカインmRNAの再現性のある発現が得られた。これらの実験において、CopaxoneまたはGMAのいずれかによる、CopaxoneまたはGMAで免疫化した動物から得たマウスに由来するリンパ節細胞の刺激により、同等のレベルのIL−2、IL−4、IL−5、およびIL−13 mRNAが得られた。
【0264】
実施例VI.リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法における使用のためのコンカナバリンAにより刺激されたマウス脾臓細胞を用いる参照遺伝子の評価
リアルタイムPCRデータの正規化のための参照遺伝子を評価するために、8つの参照遺伝子、β−アクチン、Atp5b、B2m、Cyc1、Hprt、Gapdh、Ppia、およびRp113aのmRNA発現プロファイルを、非特異的T細胞刺激剤である異なる濃度のコンカナバリンA(ConA)で処理されたCD−1マウス脾臓細胞中で試験した。データを、NormFinderプログラムを用いて分析し、参照遺伝子をその安定性に従って順位付けた。
【0265】
試験した8つの参照遺伝子を表37に列挙し、増幅および検出のために用いられたプライマー/プローブを表38に示す。
【0266】
【表42】
【0267】
【表43】
【0268】
5mgの凍結乾燥粉末を5.0mLの滅菌1X DPBSで再構成することにより、1mg/mLのConAストック溶液(ConA−SS1)を調製した。40μLのConA−SS1(1mg/mL)を1.96mLのDMEM−10培地に添加することにより、ConA−SS1溶液を20μg/mL(ConA−SS2)にさらに希釈した。異なる濃度を有するConA希釈試料を調製した。96穴組織培養プレートについて、120μLの各ConA試料を、120μLの脾臓細胞と共にウェルに添加した。
【0269】
脾細胞を4匹のメスのCD−1マウス(8週齢)から取得し、組織培養培地DMEM−10中に懸濁した。トリパンブルー色素排除法を用いて、懸濁液中の生細胞の細胞密度を決定した。細胞計数後、脾臓細胞懸濁液を7.5x10細胞/mLの密度でDMEM−10培地中で調製した。ConA希釈試料(0.12mL)を、96穴組織培養プレートの割り当てられたウェル中に添加した。同量の調製された脾臓細胞(0.12mL)を、割り当てられたウェルに添加した。モック刺激(DMEM−10培地)した脾臓細胞を用いて、各遺伝子についてバックグラウンドmRNAレベルをモニタリングした。ConAによる刺激を、表39にまとめる。プレートを、加湿された5%COインキュベータ中、37℃で6hインキュベートした。
【0270】
【表44】
【0271】
試験方法XBL12094M01[1]に従って刺激後6時間で、ConA処理された脾臓細胞から全RNAを単離した。簡単に述べると、インキュベーション時間の終わりに、処理された脾臓細胞をPBSで洗浄し、RNA溶解バッファーで溶解した。溶解物を96穴結合プレートに移し、SV96 Total RNA Isolation System(Promega;カタログ番号Z3505)を用いて全RNAを単離した。試料をRNA洗浄溶液で洗浄し、DNase溶液で処理した。DNase活性を停止させ、試料をRNA洗浄溶液で再度洗浄した後、RNA試料をヌクレアーゼ非含有水を用いて真空マニホールドシステムにより96穴プレートに溶出させた。RNA試料を約−70℃で保存した。
【0272】
PHA040−036およびPHA040−037について以前に記載したように、全RNAからcDNAを合成した。簡単に述べると、High Capacity cDNA Reverse Transcription Master Mixを調製し、96穴プレート中の割り当てられたウェルに分配した。RNA試料を各ウェルに移した。逆転写を、表40に記載のプログラムに従ってThermal Cycler(2720、Applied Biosystems)により実施した。
【0273】
【表45】
【0274】
逆転写反応が完了した後、cDNA試料をリアルタイムPCRに直接用いるか、または約−20℃で保存した。
【0275】
それぞれの参照遺伝子について特異的なプライマー/プローブを用いて、リアルタイムPCRを実施した。簡単に述べると、TaqMan Universal PCR Master Mix(Cat.#4304437)、cDNA試料および特定の参照遺伝子のためのプライマー/プローブを混合することにより、PCR試料を調製した。試料プレートを、リアルタイムPCRシステム(7500、Applied Biosystems)を用いて実施した。リアルタイムPCRのためのプログラムを、表41にまとめる。
【0276】
【表46】
【0277】
NormFinder Excelマクロは、線形尺度で提供されるデータを処理する。かくして、C値を最初に線形尺度に変換した。試料の最も低いC値を、参照遺伝子内で全試料にわたって同定し、1.0に任意に設定した。相対量(RQ)を、以下の式:
RQ=1/(2(Ct_試料−Ct_min)
を用いて他の全ての試料について算出した。
【0278】
データを、Molecular Diagnostic Laboratoryのウェブサイトからの指示に従ってNormFinder分析において処理した。
【0279】
結果および考察
全部で8つの参照遺伝子の発現レベルを、リアルタイムPCRにより評価し、値をサイクル閾値(C)として直接報告した。Cは、蛍光が特定の検出閾値レベルに達するのに必要とされるサイクル数と定義され、試料中に存在する初期RNA鋳型の量に反比例する。
【0280】
ConA刺激に応答する脾臓細胞中での発現レベルに基づいて、これらの参照遺伝子を、豊富なクラス(22.8の平均C値を有するActB)、中程度に豊富なクラス(Atp5b、B2m、GAPDH、PpiaおよびRp113a)ならびに少量クラス(29を超える平均C値を有するCyc1およびHprt)に分割することができる(表42)。
【0281】
【表47】
【0282】
各参照遺伝子について、C値は、DMEM−10対照と比較して低濃度のConA(0.03〜0.1μg/mL)で処理した試料から相対的に一定のままであった。C値は、ConA濃度が増加するにつれて(0.3〜3μg/mL)低下すると考えられた。このパターンは、ConA刺激に応答して全ての参照遺伝子について観察された。C値の低下は、1および3μg/mLのConAで処理された試料中のGAPDH遺伝子についてわずかに小さかった。この結果により、参照遺伝子の発現が0.3μg/mLを超える濃度のConAで処理された試料において上方調節され得ることが示唆された。
【0283】
結論
データの分析により、以前の全実験において用いられたGAPDHと、非常に安定であると見なされたβ−アクチンの2つのハウスキーピング遺伝子の使用がデータを正規化するための合理的な選択肢であることが示唆された。
【0284】
実施例VII.3つの同一の実験における酢酸グラチラマー刺激後のマウスリンパ節細胞中のサイトカインのmRNAレベルの定量的測定のためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法の使用
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、GAで免疫化したマウスに由来するGAで刺激したLN細胞中のIL−2、IL−4、IL−5、およびIL−13 mRNAの発現を測定した。3つの同一の実験を実行した。各実験において、マウスをGAで免疫化し、各群のマウスに由来するLN細胞を、免疫化のために用いられたそれぞれ6つの濃度の同バッチのGAを用いて刺激した。GAPDHおよびβ−アクチンを、参照遺伝子として用いた。
【0285】
実験設計を、表43に示す。3つの群はそれぞれ、約8〜12週齢の4匹のメスCSJLF1/JRj(Janvier Labs)マウスからなっていた。0日目に、マウスを、4つの足蹠への0.1mLの注射容量の注射(それぞれの前足蹠に約10μL、それぞれの後足蹠に40μL)により免疫化した。免疫化は、250μgの全用量の1ロットのGA(Copaxone、バッチP53974)+CFA(0.5mg/mL)を含有していた。免疫化後10日目に、リンパ細胞を動物から単離し、DCCM−1富化培地(モック刺激した媒体対照)、2.5μg/mLのコンカナバリンA(ConA、陽性対照)またはGAを用いて刺激した。
【0286】
免疫化の10日後に、免疫化したマウスから単離したLN細胞試料を、表43に示されるように、それぞれ0.3、1、2.5、5、10、または20μg/mLのCopaxoneバッチP53974を用いて刺激した。
【0287】
【表48】
【0288】
製造業者のプロトコール(Promega、Cat.#Z3500)に従ってSV96 Total RNA Isolation Systemを用いて、加湿されたCOインキュベータ中、約37℃で6時間のインキュベーション後、刺激されたLN細胞から全RNAを単離した。製造業者のプロトコールに従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies、以前のApplied Biosystems)を用いて、各RNA試料から3回、cDNAを合成した。以下のプログラムを用いてThermal Cycler(2720、Life Technologies)を用いて逆転写を実施した。
【0289】
【表49】
【0290】
サイトカインおよびハウスキーピング遺伝子のためのマウスプライマー/プローブを、以下の表44に列挙する(Life Technologies)。
【0291】
【表50】
【0292】
試料を、TaqMan Universal PCR Master Mix II(Life Technologies)を用いて調製し、リアルタイムPCRのために以下のプログラムを用いるリアルタイムPCRシステム(7500、Life Technologies)を用いて96穴プレート中で実行した。
【0293】
【表51】
【0294】
サイトカインmRNAのレベルを、標準的なΔΔC法を用いて以前に記載のように算出した。観察されたマウスIL−2、IL−4、IL−5およびIL−13 mRNAの発現レベルを、以下の表45〜48にまとめる。GAPDHおよびβ−アクチン遺伝子発現による正規化後のサイトカインmRNAレベルの増加倍数は同等であった。
【0295】
【表52】
【0296】
【表53】
【0297】
【表54】
【0298】
【表55】
【0299】
最も高いGA刺激濃度である20μg/mLを用いて刺激した試料中の3つの群に由来するmRNAレベルの誘導倍数を、表49にまとめる。
【0300】
【表56】
【0301】
結論
GAで免疫化したマウスから単離したリンパ節(LN)細胞中のマウスIL−2、IL−4、IL−5およびIL−13の発現レベルを、GAを用いて刺激したGAで免疫化したマウスLN細胞中で測定した。GAPDHおよびβ−アクチン遺伝子発現による正規化後のサイトカインmRNAレベルの増加倍数は同等であった。さらに、マウスサイトカインIL−2、IL−4、IL−5およびIL−13のmRNAの発現レベルは、GAで免疫化したマウスから単離したLN細胞中でGA刺激に応答して増加し、これらの増加は用量依存的であった。
【0302】
IL−2 mRNAの測定により、最も高い変動性が示されたが、GA刺激に応答したIL−4、IL−5、およびIL−13 mRNAの検出はこれらの実験においてより再現性が高かった。これらの結果は、GAで免疫化したマウスに由来するLN細胞中のGA刺激されたIL−4、IL−5、またはIL−13 mRNAの測定が、IL−2 mRNAの測定よりも再現性が高く、信頼性が高い評価方法を提供し得ることを示唆している。
【0303】
実施例VIII.リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法を用いる12ロットのGAによる刺激後のマウスLN細胞中でのサイトカインmRNA発現の比較
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、12のGAロットの1つによる刺激後に、GAで免疫化したマウスに由来するLN細胞中でのIL−2、IL−4、IL−5、およびIL−13 mRNAの発現を測定した。1ロットのGA(Copaxone P53974)を、免疫化のために用いた。刺激のために用いられたGAロットは、8つのCopaxoneロット(P53974、X06511、X06841、X06861、X06941、X06741、X06901、P63020)、および4つのGMAロット(GMA/0.02/001/13、GMA/0.02/002/13、GMA/0.02/003/13、およびGMA/R&D/026/11)を含んでいた。実験設計を表50に示す。約8〜12週齢の20匹のメスのCSJLF1/JRjマウス(Janvier Labs)を、0日目に4つの足蹠に0.1mLの注射容量(それぞれの前足蹠に約10μL、それぞれの後足蹠に40μL)の注射により免疫化した。免疫化は、250μgの全用量の1ロットのGA(CopaxoneバッチP53974)+CFA(0.5mg/mL)を含んでいた。免疫化後10日目に、動物からリンパ節を単離し、表50に示されるように、DCCM−1富化培地(モック刺激した媒体対照)、2.5μg/mLのコンカナバリンA(ConA、陽性対照)または0.3、1、2.5、5、10、もしくは20μg/mLのCopaxoneバッチP53974を用いて刺激した。
【0304】
【表57】
【0305】
製造業者のプロトコール(Promega、Cat.#Z3500)に従ってSV96 Total RNA Isolation Systemを用いて、刺激されたLN細胞から全RNAを単離した。製造業者のプロトコールに従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Life Technologies、以前のApplied Biosystems)を用いて、各RNA試料から3回、cDNAを合成した。逆転写を、以下のプログラムを用いてThermal Cycler(2720、Life Technologies)により実施した。
【0306】
【表58】
【0307】
用いたサイトカインおよびハウスキーピング遺伝子のためのマウスプライマー/プローブは、Life Technologiesからのものであった:β−アクチン(参照遺伝子、Cat.#Mm00607939_s1)、GAPDH(参照遺伝子、Cat.#Mm99999915_g1)、IL−2(標的遺伝子、Cat.#Mm00434256_m1)、IL−4(標的遺伝子、Cat.#Mm00445259_m1)、IL−5(標的遺伝子、Mm00439646_m1)、IL−13(標的遺伝子、Mm00434204_m1)、IL−17、およびCD25。
【0308】
TaqMan Universal PCR Master Mix II(Life Technologiesを用いて試料を調製し、以下のRT−PCRプログラムを用いるリアルタイムPCRシステム(7500、Life Technologies)を用いて96穴プレート中で実行した。
【0309】
【表59】
【0310】
サイトカインmRNAのレベルを、以前に記載した標準的なΔΔC法を用いて算出した。観察されたマウスIL−2、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、およびCD25 mRNAの発現レベルを、以下の表51〜71にまとめる。
【0311】
CopaxoneロットC1〜C8を用いて刺激した試料中のIL−2、IL−4、IL−5およびIL−13の発現レベル間の変動を観察した。MylanロットM1、M2およびM3の間で観察された変動は、Copaxoneの間で観察された変動よりも大きくなかった。しかしながら、GMAロットM4(合成の最初の5分間にわたってチロシンを抑制することにより作製された、変更したロットGMA/R&D/026/11)を用いて刺激したLN細胞は、有意により低いレベルのサイトカイン発現、および異なる誘導パターンを示した(表57、61、65、67および69)。
【0312】
IL−17は、4つのロットのCopaxoneおよび4つのロットのMylan GAを用いて刺激したLN細胞において濃度依存的誘導を示した(表68および69)。CD25(IL−2ra)mRNAの刺激が刺激の6時間後に採取された試料中で観察されたが、その規模は小さく、用量応答は明らかではなかった(表70および71)。β−アクチンにより正規化されたサイトカインmRNAの発現レベルは、GAPDHにより正規化されたものよりも低い変動性を示した。
【0313】
【表60】
【0314】
【表61】
【0315】
【表62】
【0316】
【表63】
【0317】
【表64】
【0318】
【表65】
【0319】
【表66】
【0320】
【表67】
【0321】
【表68】
【0322】
【表69】
【0323】
【表70】
【0324】
【表71】
【0325】
【表72】
【0326】
【表73】
【0327】
【表74】
【0328】
【表75】
【0329】
【表76】
【0330】
【表77】
【0331】
【表78】
【0332】
【表79】
【0333】
【表80】
【0334】
結論
GAで免疫化したマウスから単離したリンパ節(LN)細胞中のマウスIL−2、IL−4、IL−5、IL−13、IL−17、およびCD25の発現レベルを、インビトロでGAを用いて刺激した、GAで免疫化したマウスLN細胞中で測定した。変更したGMAの製造バッチを含む、12の異なるGAロットを、刺激のために用いた。Copaxone(登録商標)ロットC1〜C8を用いて刺激した試料中のIL−2、IL−4、IL−5およびIL−13の発現レベル間の変動を観察した。MylanロットM1、M2およびM3間で観察された変動は、Copaxone(登録商標)ロット間で観察された変動の規模の範囲内にあった。GMAロットM4(合成の最初の5分間にわたってチロシンを抑制することにより作製された、変更したロットGMA/R&D/026/11)を用いて刺激したLN細胞は、有意により低いレベルのサイトカイン発現、および異なる誘導パターンを示した。IL−17は、4つのロットのCopaxone(登録商標)および4つのロットのMylan GAを用いて刺激したLN細胞中で濃度依存的誘導を示した。
【0335】
実施例IX.酢酸グラチラマーを用いるチャレンジ後のGAで免疫化したCSJLF1/JRjマウスに由来するT細胞中の応答バイオマーカーmRNAのパネルを測定することによる酢酸グラチラマーの試験ロットの効力の決定
実施例IIIに記載したように、CSJLF1/JRjマウスを、250μgのGAの参照標準ロット(Copaxone、Teva Pharmaceuticals USA,Inc.)を用いてそれぞれ免疫化する。免疫化後10日目に、動物からリンパ節細胞を単離し、別々の試料を、ミエリン塩基性タンパク質(MBP、陰性対照)、コンカナバリンA(ConA、陽性対照)、GAの試験ロット(GMA、Mylan Pharmaceuticals,Inc.、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、および15μg/mL)ならびにGAの参照標準ロット(0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、および15μg/mL)を用いて刺激する。
【0336】
4時間および6時間後、各試料中の細胞を溶解し、全RNAを単離し、cDNAを合成し、以前に記載したリアルタイムPCRによりGA応答バイオマーカーmRNA IL−4、IL−5、IL−13、IL−17の量を測定する。GMAで免疫化したマウスに由来する細胞中で測定された各バイオマーカーmRNAの量を、Copaxoneで免疫化したマウス中で測定された量と比較して、相対効力を決定する。
【0337】
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態はほんの一例として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、ここで、本発明から逸脱することなく、いくつかの変動、変化、および置換に気付くであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な変更を、本発明の実施において用いることができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲およびその等価物の範囲内にある方法および構造がそれによって包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】