(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】2018537976
(43)【公表日】20181227
(54)【発明の名称】組換えセリンプロテアーゼ
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/57 20060101AFI20181130BHJP
   C12N 15/63 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 1/15 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 1/19 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 1/21 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 5/10 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 9/74 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 9/72 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 9/76 20060101ALI20181130BHJP
   C12N 9/50 20060101ALI20181130BHJP
   A61K 38/48 20060101ALI20181130BHJP
   A61K 38/49 20060101ALI20181130BHJP
   A61K 38/36 20060101ALI20181130BHJP
   A61P 7/04 20060101ALI20181130BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20181130BHJP
【FI】
   !C12N15/57
   !C12N15/63 ZZNA
   !C12N1/15
   !C12N1/19
   !C12N1/21
   !C12N5/10
   !C12N9/74
   !C12N9/72
   !C12N9/76
   !C12N9/50
   !A61K38/48 100
   !A61K38/49
   !A61K38/36
   !A61P7/04
   !A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】41
(21)【出願番号】2018527905
(86)(22)【出願日】20161125
(85)【翻訳文提出日】20180719
(86)【国際出願番号】NL2016050833
(87)【国際公開番号】WO2017091074
(87)【国際公開日】20170601
(31)【優先権主張番号】15196291.7
(32)【優先日】20151125
(33)【優先権主張国】EP
(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA
(71)【出願人】
【識別番号】518183011
【氏名又は名称】アカデミシュ・ジークンホイス・ライデン
【住所又は居所】オランダ・2333・ゼットアー・ライデン・アルビーヌスドレーフ・2
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ダニエル・フェルフーフ
【住所又は居所】オランダ・2333・ゼットアー・ライデン・アルビーヌスドレーフ・2・エルウーエムセー・アイントホーフェン・ラボラトリー・オブ・エクスペリメンタル・ヴァスキュラー・メディスン・デパートメント・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス内
(72)【発明者】
【氏名】ピーテル・ハー・レイツマ
【住所又は居所】オランダ・2333・ゼットアー・ライデン・アルビーヌスドレーフ・2・エルウーエムセー・アイントホーフェン・ラボラトリー・オブ・エクスペリメンタル・ヴァスキュラー・メディスン・デパートメント・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス内
(72)【発明者】
【氏名】メティネ・ハー・アー・ボス
【住所又は居所】オランダ・2333・ゼットアー・ライデン・アルビーヌスドレーフ・2・エルウーエムセー・アイントホーフェン・ラボラトリー・オブ・エクスペリメンタル・ヴァスキュラー・メディスン・デパートメント・オブ・スロンボウシス・アンド・ヘモスタシス内
【テーマコード(参考)】
4B050
4B065
4C084
【Fターム(参考)】
4B050CC04
4B050DD11
4B050LL01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA33
4B065CA44
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084DC03
4C084DC18
4C084DC21
4C084NA14
4C084ZA531
4C084ZA532
4C084ZC191
4C084ZC192
(57)【要約】
本発明は、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤で治療されている対象における、セリンプロテアーゼ阻害剤の存在下でセリンプロテアーゼ活性を有し、セリンプロテアーゼ阻害剤作用を完全に又は部分的に逆転できる、セリンプロテアーゼポリペプチドを含む組換えタンパク質に関する。より具体的には、凝固阻害剤の抗凝固作用を完全に又は部分的に逆転させるための、組換えタンパク質及び方法が本明細書中に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
外表面ペプチド構造中に少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を含むセリンプロテアーゼを含む組換えタンパク質であって、セリンプロテアーゼポリペプチドが、凝固因子Xポリペプチド又はその自然でプロセスされる又は活性化される形態ではない、組換えタンパク質。
【請求項2】
前記ペプチド構造は、配列番号1のHis-450とAsp-462の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域である、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項3】
セリンプロテアーゼは、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータから選択され;前記ペプチド構造は:
トロンビンの配列番号1のGly-427とAsp-462の間、好ましくはHis-450とAsp-462の間、より好ましくはHis-450とLeu-459の間のアミノ酸残基の領域;
凝固因子XIaの配列番号2のVal-463とAsp-480の間、好ましくはHis-469とAsp-480又はSer-477の間のアミノ酸残基の領域;
トリプシンの配列番号3のLeu-73とAsp-107の間、好ましくはHis-96とAsp-107又はLeu-104の間のアミノ酸残基の領域;
ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの配列番号4のVal-237とAsp-275の間、好ましくはHis-262とAsp-275又はAsn-274の間のアミノ酸残基の領域
である、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項4】
挿入が、1〜50個、好ましくは1〜20個のアミノ酸残基を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項5】
挿入が、4と50個の間、好ましくは4と20個の間のアミノ酸残基を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項6】
少なくとも1個のアミノ酸残基の挿入が、前記領域における少なくとも5個のアミノ酸残基の置換と組み合わされている、請求項2から5のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項7】
挿入及び/又は置換後、前記領域が、
配列番号1のHis-450とAsp-462の間に配列番号5、配列番号6、配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16;
配列番号2のHis-469とAsp-480の間に配列番号7又は配列番号8;
配列番号3のHis-96とAsp-107の間に配列番号9又は配列番号10;
及び/又は配列番号4のHis-262とAsp-275の間に配列番号11又は配列番号12のアミノ酸配列を有する、請求項2から6のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項8】
配列番号1のIle-542に対応するアミノ酸残基位置にアミノ酸残基の置換を有するセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、セリンプロテアーゼポリペプチドが、凝固因子Xポリペプチド又はその自然でプロセシングされる若しくは活性化される形態ではない、組換えタンパク質。
【請求項9】
請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするDNA配列を含む核酸分子。
【請求項10】
請求項9に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項11】
請求項9に記載の核酸分子又は請求項10に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項12】
請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項13】
医薬としての使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記タンパク質がトロンビン又は凝固因子XIaを含む、対象における凝固阻害剤の抗凝固作用を逆転させる方法における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項15】
対象における凝固阻害剤の抗凝固作用を逆転させる方法であって、
トロンビン又は凝固因子XIaを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質又は
トロンビン又は凝固因子XIaを含むタンパク質を含む、請求項12に記載の医薬組成物
の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項16】
対象における凝固阻害剤の抗凝固作用を逆転させるための医薬の製造のための、トロンビン又は凝固因子XIaを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項17】
対象におけるトリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を逆転させる方法における使用のための、トリプシンを含む請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質又はトリプシンを含む請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項18】
対象におけるトリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を逆転させる方法であって、治療有効量の、トリプシンを含む請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質又はトリプシンを含むタンパク質を含む請求項12に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項19】
対象におけるトリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を逆転させるための医薬の製造のための、トリプシンを含む請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項20】
トリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を逆転させることにおける、トリプシンを含む請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質の非治療的使用。
【請求項21】
前記タンパク質が、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータを含む、対象における抗線維素溶解作用を完全に又は部分的に逆転させることにおける使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項12に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学的目的の調製の分野のものである。より具体的には、本発明は、セリンプロテアーゼ阻害剤の存在下でセリンプロテアーゼ活性を有する、特定の組換えセリンプロテアーゼに関する。
【背景技術】
【0002】
現在、着々と多数のセリンプロテアーゼ阻害剤が開発されており、これによりセリンプロテアーゼが、プロテアーゼ活性を作用させることを防止又は阻害される。セリンプロテアーゼ(又はセリンエンドペプチダーゼ)は、セリンが、プロテアーゼの活性部位で求核性アミノ酸として働く、タンパク質中のペプチド結合を切断する酵素である(Hedstrom、2002. Chem Rev 102: 4501〜4524頁)。セリンプロテアーゼは、ヒトにおいて、消化、免疫応答、血液凝固及び生殖を含む、様々な生理的なプロセスのコーディネートを担っている(Hedstrom、2002. Chem Rev 102: 4501〜4524頁)。いくつかの周知のセリンプロテアーゼには、トロンビン、血液擬固因子XIa、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ及びトリプシンが含まれ、最初の2つは血液凝固に関与する。
【0003】
セリンプロテアーゼを、化学合成阻害剤及び天然タンパク質阻害剤を含む多様なグループの阻害剤によって阻害することができる。天然阻害剤のファミリーの1つは、「セルピン」(セリンプロテアーゼ阻害剤の省略)と呼ばれ、セリンプロテアーゼと共有結合を形成することができ、それによって、その機能を阻害する。いくつかの最もよく研究されているセリンプロテアーゼ阻害剤は、抗トロンビン及びアルファ1アンチトリプシンであり、それぞれ血液凝固及び肺気腫における、それらの役割について知られている。
【0004】
直接的なトロンビン阻害剤(DTI)等の直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤が開発されており、近い将来に抗トロンビン等の古典的な経口抗凝固剤の大部分を置き換えることが期待されている。その理由は、それらの急速な治療有効性、投薬の簡便性、及びモニタリングの必要性がないからである(He et al.、2015. Molecules 20、11046〜11062頁;Wang et al.、2015. Arch Pharm 348: 595〜605頁)。これらの阻害剤は、セリンプロテアーゼの活性部位を標的とし、一般的に経口投与に適切な小分子である。一価DTIには、とりわけ、アルガトロバン、メラガトラン又はそのプロドラッグであるキシメラガトラン、ダビガトラン又はそのプロドラッグであるダビガトランエテキシラート又はその類似体、ペプチド又はペプチドミメティックス阻害剤(Mehta et al.、2014. Expert Opin Ther Pat 24: 47〜67頁)、RWJ-671818又はその類似体(Lu et al.、2010. J Med Chem 53: 1843〜1856頁)、3-(2-フェネチルアミノ)-6-メチル-1-(2-アミノ-6-メチル-5-メチレンカルボキサミドメチルピリジニル)ピラジノン又はその類似体、(Sanderson et al.、1998. J Med Chem 41: 4466〜4474頁)、(E)-N-(3-((1-(ベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)フェニル)-2-(3-クロロフェニル)エテンスルホンアミド又はその類似体(Siles et al.、2011. Bioorg med Chem Lett 21: 5305〜5309頁)、N-{3-[(3-フルオロベンジル)オキシ]フェニル}-1-ピリジン-4-イルピペリジン-4-カルボキサミド又はその類似体(de Candia et al.、2013. J Med Chem 56: 8696〜8711頁)、及びMerckによる化合物2又はその類似体(Morrissette et al.、2004. Bioorg Med Chem Lett 14: 4161〜4164頁)が含まれる。一価DTIは、トロンビンの活性部位に強く結合してそのプロテアーゼ活性を停止させるように特異的に設計されている。
【0005】
一価の直接的な阻害剤は、凝固因子XIaに関しても見出されており、とりわけ、4、5、6-三置換ピリミジン誘導体(米国特許第US8609676 B2号)、BMS-262084(Schumacher et al.、2007. Eur J Pharmacol 570: 167〜174頁)、Bristol-Meyers Squibbの化合物1又はその類似体(Quan et al.、J Med Chem 2014. 57: 955〜969頁)、Bristol-Meyers Squibbの化合物2及び33又はその類似体(Pinto et al.、2015. Bioorg Med Chem Lett 25: 1635〜1642頁)、AstraZenecaの化合物13又はその類似体(Fjellstrom et al.、2015. PLoS One 10: e0113705)、アリールボロン酸(Lazarova et al.、2006. Bioorg Med Chem Lett 16: 5022〜5027頁)、並びに大環状インドール(Hanessian et al.、2010. Bioorg Med Chem Lett 20: 6925〜6928頁)が含まれる。
【0006】
ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに対する一価の阻害剤には、とりわけ、WX-UK1又はそのプロドラッグUpamostat、Mesupronとしても知られている又はWX-671及びAPC-10302又はその類似体(Katz et al.、2001. Chem Biol 8: 1107〜1121頁)が含まれる。興味深いことに、直接的なトロンビン阻害剤メラガトラン及び直接的なウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤APC-10302が、トリプシンの活性部位に結合すること及びそのセリンプロテアーゼ活性を阻害することが可能であることも見出された(Dullweber et al. 2001. J Mol Biol 313: 593〜614頁; Katz et al.、2001. Chem Biol 8: 1107〜1121頁)。
【0007】
セリンプロテアーゼ阻害剤の使用の欠点は、正常なセリンプロテアーゼ活性の効果的な回復が、セリンプロテアーゼの完全な置換又は対象からの阻害剤の効果的な除去を一般的に必要とすることである。これは短所である。阻害後のセリンプロテアーゼ活性の誘導は、臨床及び非臨床設定の両方で、長期にわたり徐々にではなく、好ましくは即座に直接的に達成すべきものであるからである。例えば、抗凝固療法の状況では、特定の逆転戦略を全般的に欠いていることで、トロンビン等の阻害剤の適用後に、潜在的に生命を脅かす出血合併症をもたらし得る。後者は、オランダだけで、抗凝固剤で治療された毎年5,000人を超える患者が、800人を超える死亡を含む重篤で有害な出血イベントに苦しんでいる事実によって例示される(Adriaansen H.、et al.:「Samenvatting Medische Jaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten」、2014; 1〜38頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】EP519596
【特許文献2】米国特許第6,797,492号
【特許文献3】EP1141263 A1
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Hedstrom、2002. Chem Rev 102: 4501〜4524頁
【非特許文献2】He et al.、2015. Molecules 20、11046〜11062頁
【非特許文献3】Wang et al.、2015. Arch Pharm 348: 595〜605頁
【非特許文献4】Mehta et al.、2014. Expert Opin Ther Pat 24: 47〜67頁
【非特許文献5】Lu et al.、2010. J Med Chem 53: 1843〜1856頁
【非特許文献6】Sanderson et al.、1998. J Med Chem 41: 4466〜4474頁
【非特許文献7】Siles et al.、2011. Bioorg med Chem Lett 21: 5305〜5309頁
【非特許文献8】de Candia et al.、2013. J Med Chem 56: 8696〜8711頁
【非特許文献9】Morrissette et al.、2004. Bioorg Med Chem Lett 14: 4161〜4164頁
【非特許文献10】Schumacher et al.、2007. Eur J Pharmacol 570: 167〜174頁
【非特許文献11】Quan et al.、J Med Chem 2014. 57: 955〜969頁
【非特許文献12】Pinto et al.、2015. Bioorg Med Chem Lett 25: 1635〜1642頁
【非特許文献13】Fjellstrom et al.、2015. PLoS One 10: e0113705
【非特許文献14】Lazarova et al.、2006. Bioorg Med Chem Lett 16: 5022〜5027頁
【非特許文献15】Hanessian et al.、2010. Bioorg Med Chem Lett 20: 6925〜6928頁
【非特許文献16】Katz et al.、2001. Chem Biol 8: 1107〜1121頁
【非特許文献17】Dullweber et al. 2001. J Mol Biol 313: 593〜614頁
【非特許文献18】Adriaansen H.、et al.:「Samenvatting Medische Jaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten」、2014; 1〜38頁
【非特許文献19】Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest、4th ed.、Bethesda、Md.、National Institutes of Health
【非特許文献20】Padlan et al.、1991. Mol Immunol 28: 489〜498頁
【非特許文献21】Sarkar et al.、2012、Journal of Lipids、Article ID 610937、p. 1〜13頁
【非特許文献22】Huntington、2005. J Thromb Haemos 3: 1861〜1872頁
【非特許文献23】Lane et al.、2005. Blood: 106: 2605〜2612頁
【非特許文献24】Green and Sambrook、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、CSHL Press、2012
【非特許文献25】Graham et al.、1973. Virology 52: 456頁
【非特許文献26】Green et al.、2012.「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、CSHL Press
【非特許文献27】Davis et al.、「Basic Methods in Molecular Biology」、1986、Elsevier
【非特許文献28】Chu et al.、1981. Gene 13: 197
【非特許文献29】Hauel et al.、J Med Chem 45: 1757〜1766頁(2002)
【非特許文献30】Higgins et al. 1983. J Biol Chem 258: 6503〜6508頁
【非特許文献31】Green and Sambrook、Molecular Cloning、4th edition、July 2012
【非特許文献32】Orcutt et al. 2004. J Biol Chem 279: 54927〜54936頁
【非特許文献33】Lundblad et al.、1976. Methods Enzymol 45: 156〜176頁
【非特許文献34】Toso et al. 2004. J Biol Chem 279: 21643〜21650頁
【非特許文献35】Ogawa et al.、2005. J Biol Chem 280: 23523〜23530頁
【非特許文献36】Hemker et al.、2003. Pathophysiol Haemost Thromb 33: 4〜15頁
【非特許文献37】Mosnier et al.、2001. Thromb Haemost 86: 1035〜1039頁
【非特許文献38】Higgins et al.、J Biol Chem 258: 6503〜6508頁(1983)
【非特許文献39】Orcutt et al.、J Biol Chem、279: 54927〜54936頁(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
現時点で、セリンプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を防止する及び停止させる直接的及び即時的な逆転戦略は、利用可能ではない。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、この問題を、セリンプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を防止する及び停止させる適切な逆転戦略として、トロンビン、凝固因子XIa、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ及びトリプシンを含む群から選択されるセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供することによって解決し、前記ポリペプチドは、外表面ペプチド構造中の少なくとも1つのアミノ酸の挿入を含み、前記ペプチド構造は、配列番号1のGly-427とAsp-462の間、好ましくはHis-450とAsp-462の間、より好ましくはHis-450とLeu-459の間のアミノ酸残基の領域;配列番号2のVal-463とAsp-480の間、好ましくはHis-469とAsp-480又はSer-477の間のアミノ酸残基の領域;配列番号3のLeu-73とAsp-107の間、好ましくはHis-76とAsp-107の間、より好ましくはGln-87とAsp-107の間、及び最も好ましくはHis-96とLeu-104又はAsp-107の間のアミノ酸残基の領域;配列番号4のVal-237とAsp-275の間、好ましくはPhe-254又はVal-256とAsp-275又はAsn-274の間、より好ましくはHis-262とAsp-275、Asn-274又はAla-271の間のアミノ酸残基の領域である。
【0012】
好ましくは、セリンプロテアーゼポリペプチドは、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータであり、好ましくはヒトトロンビン、ヒト凝固因子XIa、ヒトトリプシン及びヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータからなる群から選択される。配列番号1はヒトプロトロンビンのアミノ酸配列を提供し、配列番号2はヒト凝固因子XIのアミノ酸配列を提供し、配列番号3はヒトトリプシン-1のアミノ酸配列を提供し、及び配列番号4はヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータのアミノ酸配列を提供することに注意されたい。
【0013】
変更したアミノ酸組成、好ましくは少なくとも1つのアミノ酸の挿入を、トロンビンに関して配列番号1のGly-427とAsp-462の間の領域中に、凝固因子XIaに関して配列番号2のVal-463とAsp-480又はSer-477の間の領域中に、トリプシンに関して配列番号3のLeu-73とAsp-107の間の領域中に、又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4のVal-237とAsp-275の間の領域中に有する、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータにより形成される群から選択されるセリンプロテアーゼポリペプチドが、セリンプロテアーゼ阻害剤の存在下で触媒的に活性であることが見出された。これは、セリンプロテアーゼとその阻害剤の複合体の利用可能な結晶構造からは、外表面ペプチド構造中のアミノ酸残基が阻害剤と接触しないことが示されるので、驚くべきことである(例えば、図2〜図4を参照されたい)。
【0014】
加えて、外表面ペプチド構造におけるアミノ酸残基は、組成(すなわち、アミノ酸残基の同一性)もアミノ酸残基の数も、トロンビン、ヒト凝固因子XIa、ヒトトリプシン及びヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの間で保存されていない可動性ループ構造を形成するように見える。(少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入による)このループの改変が、セリンプロテアーゼに対する阻害剤の結合及び/又は阻害剤の結合後のセリンプロテアーゼの活性を変化させるとは考えられていなかった。
【0015】
加えて、トロンビン、ヒト凝固因子XIa、ヒトトリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの既知の阻害剤は、構造的に無関係の化合物である。このことにより、更に、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータセリンプロテアーゼの外表面ペプチド構造における少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入が、阻害剤による阻害に対する感受性が低下したセリンプロテアーゼをもたらす可能性は、先験的には低い。
【0016】
組換えセリンプロテアーゼは、前記変更したアミノ酸組成を有していないセリンプロテアーゼと比較して、セリンプロテアーゼ阻害剤による阻害に対する感受性が低下する。したがって、本発明は、遊離の内因性セリンプロテアーゼの生成に依存しないセリンプロテアーゼ阻害剤に対する解毒剤を提供するとともに、セリンプロテアーゼ阻害剤の阻害効果を防止する及び停止するための迅速且つ直接的な逆転戦略を提供する。
【0017】
本明細書で使用される「セリンプロテアーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解することによってタンパク質を分解し、活性部位中の活性なセリン残基を有していることによって主に特徴付けされる酵素を指す。セリンプロテアーゼは、セリンエンドペプチダーゼとも一般に呼ばれる。好ましくは、「セリンプロテアーゼ」という用語は、例えば、配列番号1中のHis-406、Asp-462及びSer-568として示される、触媒性のトライアッドアミノ酸残基ヒスチジン、アスパラギン酸及びセリンの空間的な配置を有する酵素を指す。当業者は、セリンエンドペプチダーゼ中の触媒性のトライアッドアミノ酸残基を容易に評価し、見出すことができる。その用語には、酵素クラス(EC)3.4.21、例えば、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、凝固因子VIIa、凝固因子IXa、凝固因子XIa、エラスターゼ、グランザイムA、グランザイムB、カリクレイン8並びにこれらのセリンプロテアーゼの前駆体、例えば、不活性のプレプロ-及びプロ-前駆体に含まれるセリンエンドペプチダーゼを含む。好ましくは、セリンプロテアーゼポリペプチドは、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドであり、好ましくはトロンビン、凝固因子XIa、トリプシン又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドからなる群から選択される。タンパク質がセリンプロテアーゼであるかどうかを決定する方法は、当技術分野で公知であり、配列比較及びSigma-Aldrich等のプロテアーゼ検出キットの使用を含む。
【0018】
ヒトプロトロンビンのアミノ酸配列は、配列番号1に提供され、GENBANK(登録商標)受託番号AAC63054.1に見出すことができる。配列番号1に列挙された配列を有するプロトロンビンは、プレプロリーダー配列(配列番号1のアミノ酸残基1から43)を含有する前駆体であり、続いて活性化ペプチド断片1に対応する配列(アミノ酸残基44〜198)及び引き続き活性化ペプチド断片2(アミノ酸残基199〜327)、続いてトロンビン軽鎖(アミノ酸残基328〜363)及びトロンビン重鎖(アミノ酸残基364〜622)を含む。本明細書で使用される用語「プロトロンビン」は、不活性プロトロンビン前駆体タンパク質を指す。本明細書で使用される用語「トロンビン」は、トロンビン軽鎖及び重鎖を有するプロトロンビンの触媒活性形態を指す。本明細書で使用される定義によると、プロトロンビンは、トロンビンポリペプチドを含む。
【0019】
本発明の文脈において、タンパク質は、それが凝血促進性セリンプロテアーゼである場合、プロトロンビン又はトロンビンポリペプチドであり、好ましくは、これはフィブリノーゲンにおけるArg-|-Gly結合を切断してフィブリンを形成し、フィブリノペプチドA及びBを放出する。好ましくは、トロンビン(フィブリノゲナーゼとも称される)は、異なる種のプロトロンビン又はトロンビンポリペプチドの間で保存されている一続きのアミノ酸残基に対応する一続きのアミノ酸残基を含む。例えば、配列番号1のアミノ酸残基Arg-338からGlu-343、Pro-376からLeu-381、Ser-385からLeu-395、Arg-461からLeu-465、Lys-498からLeu-507、Lys-559からLys-575及びGly-586からArg-596に対応する一続きのアミノ酸残基を含有するポリペプチドを含む凝血促進性セリンプロテアーゼは、プロトロンビン又はトロンビンポリペプチドであると推定される。「プロトロンビン」又は「トロンビン」という用語は、EC3.4.21.5において参照されるセリンプロテアーゼに対する参照を含む。
【0020】
例えば、(i)トロンビンに関して、ChromogenixのS-2238(商標)基質(Instrumentation Laboratoryのブランド(Bedford、MA、USA)式Bz-IIe-Glu(ガンマ-OR)-Gly-Arg-pNA・HCl(R=H(50%)及びR=CH3(50%);分子量:741.3;品番:82 0316 39)で製造者の指示書に従って、及び/又は(ii)Pefachrome(登録商標)THシリーズ発色性基質(DSM Nutritional Products、CH)化学式Tos-Gly-Pro-Arg-pNA・AcOH; H-D-CHG-Ala-Arg-pNA・2AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA・2AcOH; H-D-CHG-Pro-Arg-pNA・2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA 2AcOH; H-D-CHA-Gly-Arg-pNA・2AcOH; CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA・AcOH及び/又はH-ベータ-Ala-Gly-Arg-pNA・2AcOH、等のその目的に適切な基質においてタンパク分解性切断を試験することによって、セリンプロテアーゼが実際にトロンビンであるかどうかを当業者は実証することができる。
【0021】
ヒト凝固因子XIのアミノ酸配列は、配列番号2に提供され、GENBANK(登録商標)受託番号AAA51985.1に見出すことができる。配列番号2において提供される配列を有する凝固因子XIは、シグナルペプチド(アミノ酸残基1〜18)、凝固因子XIa重鎖(アミノ酸残基19〜387)及び凝固因子XIa軽鎖(アミノ酸残基388〜625)を含有する前駆体タンパク質である。本明細書で使用される用語「凝固因子XI」は、不活性凝固因子XI前駆体タンパク質を指す。本明細書で使用される用語「凝固因子XIa」は、凝固因子XIa重鎖及び凝固因子XIa軽鎖を有する凝固因子XIの触媒活性形態を指す。本明細書で使用される定義によると、凝固因子XIは、凝固因子XIaポリペプチドを含む。
【0022】
本発明の文脈において、タンパク質は、IX因子におけるArg-|-Ala及びArg-|-Val結合を選択的に切断してIXa因子を形成する凝血促進剤である場合、凝固因子XI又は凝固因子XIaポリペプチドであることが考慮される。前記タンパク質の完全長アミノ酸配列は、好ましくは、異なる種の凝固因子XI又は凝固因子XIaポリペプチドの間で保存されている一続きのアミノ酸残基に対応する一続きのアミノ酸残基を含む。例えば、配列番号2のアミノ酸残基Asp-480からAla-482、Cys-560からGly-562、及びGly-573からLeu-579に対応する一続きのアミノ酸残基を含有するポリペプチドを含む凝血促進性セリンプロテアーゼは、凝固因子XI又は凝固因子XIaポリペプチドであると推定される。「凝固因子XI」又は「凝固因子XIa」という用語は、EC3.4.21.27において参照されるセリンプロテアーゼに対する参照を含む。例えば、(i)ChromogenixのS-2366(商標)基質(Instrumentation Laboratoryのブランド(Bedford、MA、USA)式pyroGlu-Pro-Arg-pNA・HCl(分子量539.0;品番82 1090 39)で、製造者の指示書に従って、及び/又は(ii)Pefachrome(登録商標)FXIa発色性基質(DSM Nutritional Products、CH)化学式Z-Aad-Pro-Arg-pNA AcOH)、等のその目的に適切な基質においてタンパク分解性切断を試験することによって、セリンプロテアーゼが凝固因子XI又は凝固因子XIaポリペプチドであるかどうかを当業者は実証することができる。
【0023】
ヒトトリプシン-1のアミノ酸配列は、配列番号3に提供され、GENBANK(登録商標)受託番号「NP_002760.1」に見出すことができる。配列番号3に提供される配列を有するトリプシン-1は、シグナルペプチド(アミノ酸残基1〜15)、活性化ペプチド(アミノ酸残基16〜23)、アルファ-トリプシン鎖1(アミノ酸残基24〜122)及びアルファ-トリプシン鎖2(アミノ酸残基123〜247)を有する前駆体タンパク質である。二鎖形態は、配列番号3の残基Arg-122後のタンパク分解性切断によって産生される。アルファ-トリプシン鎖が、1つの触媒活性ペプチド鎖(アミノ酸残基24〜247)として存在できることに注意されたい。トリプシンが、セリンプロテアーゼの原型(archetype)であることが一般的に知られている。本明細書で使用される用語「トリプシン」は、不活性トリプシン前駆体タンパク質、触媒活性単一鎖形態及び別個のアルファ-トリプシン鎖1及びアルファ-トリプシン鎖2を有する触媒活性二鎖形態を指す。
【0024】
本発明の文脈において、タンパク質は、優先的にはArg-|-Xaa、Lys-|-Xaaを切断するセリンプロテアーゼである場合、トリプシンポリペプチドであることが考慮される。前記タンパク質の完全長アミノ酸配列は、好ましくは、異なる種のトリプシンポリペプチドの間で保存されている一続きのアミノ酸残基に対応する一続きのアミノ酸残基を含む。例えば、配列番号3のアミノ酸残基Phe-47からGly-50、Gly-191からGln-197、Asp-199からPro-203、及びVal-214-Gly-217に対応する一続きのアミノ酸残基を含有するポリペプチドを含むセリンプロテアーゼは、トリプシンポリペプチドであると推定される。用語「トリプシン」は、優先的にはArg-|-Xaa、Lys-|-Xaaを切断する及び/又はEC3.4.21.4に列挙されるセリンプロテアーゼに対する参照を含む。したがって、用語「トリプシン」は、トリプシン1、例えば、トリプシン2、トリプシン3、トリプシン3、トリプシン4、トリプシン5及びトリプシン6以外のトリプシンタンパク質に対する参照を含む。前記トリプシンは、好ましくはトリプシン1である。例えば、(i)ChromogenixのS-2222(商標)基質(Instrumentation Laboratoryのブランド(Bedford、MA、USA)式:Bz-Ile-Glu(ガンマ-OR)-Gly-Arg-pNA・HCl(R=H(50%)及びR=CH3 (50%)で分子量741.3を有する;カタログ番号S820316)で、製造者の指示書に従って、及び/又は(ii)Pefachrome(登録商標)TRY(トリプシン)発色性基質(DSM Nutritional Products、CH)化学式Cbo-Val-Gly-Arg-pNA・AcOH、等のその目的に適切な基質においてタンパク分解性切断を試験することによって、セリンプロテアーゼがトリプシンであるかどうかを当業者は実証することができる。
【0025】
ヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータのアミノ酸配列は、配列番号4に提供され、GENBANK(登録商標)受託番号「AAK53822.1」に見出すことができる。配列番号4に提供される配列を有するウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータは、シグナルペプチド(アミノ酸残基1〜20)、並びに長鎖A(アミノ酸残基21〜177)、短鎖A(アミノ酸残基156〜177)及び鎖B(アミノ酸残基179〜431)に細分することができる鎖(アミノ酸残基21〜431)を有する前駆体タンパク質である。本明細書で使用される用語「ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ」は、不活性ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ前駆体タンパク質及びその触媒活性鎖形態を指す。
【0026】
本発明の文脈において、タンパク質は、プラスミノーゲンにおけるArg-|-Val結合を特異的に切断してプラスミンを形成するセリンプロテアーゼである場合、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータであることが考慮される。前記タンパク質の完全長アミノ酸配列は、好ましくは、異なる種のウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドの間で保存されている一続きのアミノ酸残基に対応する一続きのアミノ酸残基を含む。例えば、配列番号4のアミノ酸残基His-119からAsn-124及び/又はAsn-274からLeu-278に対応する一続きのアミノ酸残基を含有し、プラスミノーゲンにおけるArg-|-Val結合を特異的に切断してプラスミンを形成する、ポリペプチドを含むセリンプロテアーゼは、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドであると推定される。
【0027】
例えば、(i)ChromogenixのS-2444(商標)基質(Instrumentation Laboratoryのブランド(Bedford、MA、USA)式Glu-Gly-Arg-pNA HCl(分子量498.9)で、製造者の指示書に従って、及び/又は(ii)ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して、Pefachrome(登録商標)uPA-シリーズ発色性基質(DSM Nutritional Products、CH) 化学式Bz-ベータ-Ala-Gly-Arg-pNA・AcOH及び/又はCbo-Glu(OtBu)-Gly-Arg-pNA AcOH、等のその目的に適切な基質においてタンパク分解性切断を試験することによって、セリンプロテアーゼがウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータであるかどうかを当業者は実証することができる。
【0028】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、当業者に公知の組換えDNA技術を用いて産生されるタンパク質を指す。組換えタンパク質は、例えば、アミノ酸残基の交換及び/又は1つ又は複数のアミノ酸残基の欠失又は挿入に起因してアミノ酸組成が異なるため、及び/又はグリコシル化等の翻訳後修飾の違いのため、天然(native)のタンパク質と同一ではないことが好ましい。
【0029】
本明細書で使用される「セリンプロテアーゼを含む組換えタンパク質」という語句は、組換えセリンプロテアーゼポリペプチド、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、及び最も好ましくはヒト起源のものを含むタンパク質を包含することを意味する。この語句は、例えば、哺乳動物トロンビンポリペプチドにプロセシング及び/又は活性化される、プロトロンビン等の組換え哺乳類セリンプロテアーゼ前駆体タンパク質を含む。したがって、本発明のタンパク質は、好ましくは、外表面ペプチド構造中の少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を含む、組換え哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒト若しくはヒト化、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータであり、前記ペプチド構造は、トロンビンに関して、配列番号1のGly-427とAsp-462の間、好ましくはHis-450とAsp-462の間、より好ましくはHis-450とLeu-459の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域;凝固因子XIaに関して、配列番号2のVal-463とAsp-480の間、好ましくはHis-469とAsp-480又はSer-477の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域;トリプシンに関して、配列番号3のLeu-73とAsp-107の間、好ましくはHis-96とAsp-107又はLeu-104の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域;及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの配列番号4のVal-237とAsp-275、好ましくはPhe-254又はVal-256とAsp-275又はAsn-274の間、より好ましくはHis-262とAsp-275又はAsn-274の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域である。更に、前記語句には、セリンプロテアーゼポリペプチドの他に、例えば、EP0150126に記載されているようなFLAGタグ及び/又は1つ又は複数の他の識別ペプチド等の、タグを構成するアミノ酸配列等の、1つ又は複数の更なるアミノ酸配列を含むタンパク質が含まれる。
【0030】
本明細書で使用する「ヒト化」という用語は、タンパク質のヒトホモログに存在するアミノ酸残基の一種のタンパク質の好ましくは外部アミノ酸残基の置換又はヒト化を指し、その結果、第1の種のタンパク質は、ヒトに適用された場合、免疫原性でなく、又は免疫原性が低くなる。外部残基の置換は、好ましくは、内部ドメイン又は軽鎖と重鎖との間のドメイン間接触にほとんど、又は全く影響を及ぼさない。非ヒト起源、好ましくは哺乳動物起源、より好ましくは霊長類起源の本発明のタンパク質は、ヒトに適用される場合、前記タンパク質の免疫原性を低下させるために好ましくはヒト化される。
【0031】
本発明の非ヒトタンパク質は、好ましくは、人体への投与時の抗原応答のリスクが本発明の非ヒト化セリンプロテアーゼポリペプチドを含むタンパク質と比較して低いと予想される、ヒト化哺乳動物の、より好ましくはヒト化霊長類の、セリンプロテアーゼポリペプチドを含む。
【0032】
タンパク質のヒト化の状況では、抗体に適用可能なヒト化のプロセスに注意を払ってもよい。このプロセスには、Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest、4th ed.、Bethesda、Md.、National Institutes of Healthによってまとめられたヒト抗体可変ドメインの利用可能な配列データ、該データのデータベースへのアップデート、及び、他のアクセス可能な米国及び外国のデータベース(核酸及びタンパク質の両方)を利用する。ヒト化抗体を作製するために使用される方法の非限定的な例は、EP519596;米国特許第6,797,492号;及びPadlan et al.、1991. Mol Immunol 28: 489〜498頁を含む。非ヒトタンパク質のヒト化のプロセスを更に例示すると、Sarkar et al.、2012、Journal of Lipids、Article ID 610937、p. 1〜13頁に、ヒト配列を反映するように酵素の表面を改変することによって、パラオキソナーゼ-1がうまくヒト化されたことが記載されている。
【0033】
本明細書で使用される「セリンプロテアーゼ阻害剤」という用語は、セリンプロテアーゼ活性を阻害可能な剤を指す。好ましくは、セリンプロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼの活性部位に対する結合によって作用する、一価の直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤、好ましくは小分子又はペプチド又はペプチドミメティックスである。好ましくは、セリンプロテアーゼ阻害剤は、トロンビン阻害剤、凝固因子XIa阻害剤、トリプシン阻害剤又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤である。
【0034】
本明細書で使用される「トロンビン阻害剤」という用語は、二価の直接的なトロンビン阻害剤、例えば、ヒルジン、ビバリルジン(bivalirudin)、及びレピルジン(lepirudin)を含み、トロンビンの活性部位に対する結合によって及びトロンビンのエクソサイト1に対する結合によって作用する、直接的なトロンビン阻害剤を含むが、これらに限定されない。エクソサイト1は、プロトロンビンにおいて機能的にアクセス不可能(inaccessible)であり、活性化に際して曝露されるようになる(Huntington、2005. J Thromb Haemos 3: 1861〜1872頁;Lane et al.、2005. Blood: 106: 2605〜2612頁)。用語「トロンビン阻害剤」は、トロンビンの活性部位に対する結合によって作用する、一価の直接的なトロンビン阻害剤に対する参照を更に含む(及び、好ましくは、トロンビンの活性部位に対する結合によって作用する、一価の直接的なトロンビン阻害剤である)。これらの一価の直接的なトロンビン阻害剤には、アルガトロバン((2R,4R)-1-[(2S)-5-(ジアミノメチリデンアミノ)-2-[(3-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-8-イル)スルホニルアミノ]ペンタノイル]-4-メチル-ピペリジン-2-カルボン酸)又はその生物学的に活性な類似体;メラガトラン(2-[[(1R)-2-[(2S)-2-[(4-カルバムイミドイルフェニル)メチルカルバモイル]アゼチジン-1-イル]-1-シクロヘキシル-2-オキソエチル]アミノ]酢酸)及びそのプロドラッグであるキシメラガトラン(エチル2-[[(1R)-1-シクロヘキシル-2-[(2S)-2-[[4-[(Z)-N'-ヒドロキシカルバムイミドイル]フェニル]メチルカルバモイル]アゼチジン-1-イル]-2-オキソエチル]アミノ]アセテート)又はその生物学的に活性な類似体;ダビガトラン(3-[[2-[(4-カルバムイミドイルアニリノ)メチル]-1-メチルベンゾイミダゾール-5-カルボニル]-ピリジン-2-イルアミノ]プロパン酸)又はその生物学的に活性な類似体、例えば、ダビガトランエテキシラート(エチル3-[[2-[[4-[(Z)-N'-ヘキソキシカルボニルカルバムイミドイル]アニリノ]メチル]-1-メチルベンゾイミダゾール-5-カルボニル]-ピリジン-2-イルアミノ]プロパノアート);RWJ-671818(1-{N-[2-(アミジノアミノオキシ)エチル]アミノ}カルボニルメチル-6-メチル-3-[2,2-ジフルオロ-2-フェニルエチルアミノ]ピラジノン)又はその生物学的に活性な類似体;3-(2-フェネチルアミノ)-6-メチル-1-(2-アミノ-6-メチル-5-メチレンカルボキサミドメチルピリジニル)ピラジノン又はその生物学的に活性な類似体;(E)-N-(3-((1-(ベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)フェニル)-2-(3-クロロフェニル)エテンスルホンアミド又はその生物学的に活性な類似体;及び、Merckによる化合物2 ((S)-N-(2-(アミノメチル)-5-クロロベンジル)-1-((R)-2-ヒドロキシ-3,3-ジメチルブタノイル)ピロリジン-2-カルボキサミド)又はその生物学的に活性な類似体が含まれる。好ましくは、直接的なトロンビン阻害剤は、一価の直接的なトロンビン阻害剤、好ましくは経口投与に適切な小分子、例えば、アルガトロバン、メラガトラン、及び、そのプロドラッグであるキシメラガトラン、又はダビガトラン、及び、そのプロドラッグであるダビガトランエテキシラート、又はこれらの分子の生物学的に活性な類似体である。
【0035】
或いは、直接的なトロンビン阻害剤は、ペプチド又はペプチドミメティックス阻害剤である(Mehta et al.、2014. Expert Opin Ther Pat 24: 47〜67頁)。
【0036】
本明細書で使用される用語「凝固因子XIa阻害剤」は、凝固因子XIaの活性部位に対して結合することができる及びそのプロテアーゼ活性を阻害することができる阻害剤を指す。その用語には、凝固因子XIaの活性部位に対して結合する及びそのプロテアーゼ活性を阻害する、直接的な凝固因子XIa阻害剤、好ましくは小分子が含まれる。直接的な凝固因子XIa阻害剤の群には、4,5,6-三置換ピリミジン誘導体;BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(tert-ブチルカルバモイル)ピペラジン-1-カルボニル]-3-[3-(ジアミノメチリデンアミノ)プロピル]-4-オキソアゼチジン-2-カルボン酸)又はその生物学的に活性な類似体;Bristol-Meyers Squibbの化合物1 (3'-[(2S,4R)-6-カルバムイミドイル-4-メチル-4-フェニル-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-2-イル]-4-カルバモイル-5'-[(3-メチルブタノイル)アミノ]ビフェニル-2-カルボン酸)、化合物2 (トランス-N-((S)-1-(4-(3-アミノ-1H-インダゾール-6-イル)-5-クロロ-1H-イミダゾール-2-イル)-2-フェニルエチル)-4-(アミノメチル)シクロヘキサンカルボキサミド)及び化合物33 ((2E)-N-{(1S)-1-[4-(3-アミノ-1H-インダゾール-6-イル)-1H-イミダゾール-2-イル]-2-フェニルエチル}-3-[5-クロロ-2-(1H-テトラゾール-1-イル)フェニル]プロパ-2-エンアミド)、又はその生物学的に活性な類似体;AstraZenecaの化合物13 (N-[(1S)-1-ベンジル-2-[(6-クロロ-2-オキソ-1H-キノリン-4-イル)メチルアミノ]-2-オキソ-エチル]-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1H-キノリン-6-カルボ)又はその生物学的に活性な類似体;アリールボロン酸;大環状インドール;及び、ペプチド又はペプチドミメティックス阻害剤が含まれる。好ましくは、凝固因子XIa阻害剤は、凝固因子XIaの活性部位に対して結合する及びそのプロテアーゼ活性を阻害する、直接的な凝固因子XIa阻害剤、好ましくは小分子、好ましくは経口投与に適切な小分子である。
【0037】
本明細書で使用される用語「ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤」は、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの活性部位に対して結合することができる及びそのプロテアーゼ活性を阻害することができる阻害剤を指す。その用語には、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの活性部位に対して結合する及びそのプロテアーゼ活性を阻害する、直接的なウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤、好ましくは小分子が含まれる。直接的なウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤の群には、とりわけ、WX-UK1(エチル4-[(2S)-3-(3-カルバムイミドイルフェニル)-2-[[2,4,6-トリ(プロパン-2-イル)フェニル]スルホニルアミノ]プロパノイル]ピペラジン-1-カルボキシレート)、又はMesupron若しくはWX-671としても知られているそのプロドラッグUpamostat(後者:Nα-(2,4,6-トリイソプロピルフェニルスルホニル)-3-アミジノ-(L)-フェニルアラニン-4-エトキシカルボニルピペラジド)、APC-10302(6-クロロ-2-(2-ヒドロキシ-ビフェニル-3-イル)-1H-インドール-5-カルボキサミジン)又はこれらの化合物の生物学的に活性な類似体を含む。或いは、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤は、ペプチド又はペプチドミメティックス阻害剤である。好ましくは、直接的なウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータは、一価の直接的なウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤、好ましくは経口投与に適切な小分子、例えば、WX-UK1及びそのプロドラッグUpamostatである。
【0038】
本明細書で使用される用語「トリプシン阻害剤」は、トリプシンの活性部位に対して結合することができる及びそのプロテアーゼ活性を阻害することができる阻害剤を指す。その用語には、トリプシンの活性部位に対して結合する及びそのプロテアーゼ活性を阻害する、直接的なトリプシン阻害剤、好ましくは小分子が含まれる。直接的なトリプシン阻害剤の群には、メラガトラン、及び、そのプロドラッグであるキシメラガトラン(後者:エチル2-[[(1R)-1-シクロヘキシル-2-[(2S)-2-[[4-[(Z)-N'-ヒドロキシカルバムイミドイル]フェニル]メチルカルバモイル]アゼチジン-1-イル]-2-オキソエチル]アミノ]アセテート)、APC-10302(6-クロロ-2-(2-ヒドロキシ-ビフェニル-3-イル)-1H-インドール-5-カルボキサミジン)、及びこれらの分子の生物学的に活性な類似体が含まれる。
【0039】
本明細書で使用される用語「生物学的に活性な類似体」又は「類似体」は、参照化合物と同じ生物学的機能を呈し、抗凝固性又は凝固性作用等の所望の活性を保持する、示される参照化合物の誘導体又は断片を指す。したがって、類似体は、好ましくは、示される参照化合物の構造上の及び機能的な類似体である。
【0040】
本明細書で使用される用語「相同」は、2つのアミノ酸配列の比較時に同一である、アミノ酸残基のパーセンテージとして表される、2つのアミノ酸配列間のアミノ酸配列同一性を指す。前記比較は、好ましくは、2つのアミノ酸配列の全長に対して行われる。
【0041】
本明細書で使用される用語「領域」は、2つの保存されているアミノ酸残基によって境界が定められている一続きのアミノ酸残基を指す。その領域には、その領域に隣接する2つのアミノ酸が含まれる。本明細書において適用されるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4のアミノ酸配列に基づく。本明細書で使用される用語「アミノ酸の領域」には、非ヒトトロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及び/又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータにおける領域等の前記定義された領域に対応するアミノ酸残基の領域が含まれる。当業者は、例えば非ヒトトロンビン中の、この領域の位置が、配列番号1に示されるようなヒトトロンビン中の位置とは異なるであろうことを理解する。しかしながら、示される領域には、2つの保存されているアミノ酸残基が隣接し、これにより当業者は、非ヒトタンパク質中の前記定義された領域に対応する領域を識別できる。
【0042】
本明細書で使用される用語「挿入」又は「挿入された」は、天然のセリンプロテアーゼポリペプチドの特定の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の付加を指し、これにより、天然のセリンプロテアーゼポリペプチドの当該領域のアミノ酸残基の数と比較して、当該領域のアミノ酸残基の数が増加している。
【0043】
本明細書で使用する「置換」又は「置換された」という用語は、セリンプロテアーゼポリペプチドの特定の領域又は特定の部位における1つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを指し、これにより、アミノ酸配列は変更されるが、前記領域内のアミノ酸残基の数は変更されない。置換は、アミノ酸残基の欠失の後に、同じ位置に異なるアミノ酸残基が挿入された結果である。
【0044】
本明細書で使用される用語「欠失」又は「欠失した」は、セリンプロテアーゼポリペプチドの特定の領域における又は特定の部位での、1つ又は複数のアミノ酸残基の欠失を指し、これにより、天然のセリンプロテアーゼポリペプチドの当該領域のアミノ酸残基の数と比較して、前記ポリペプチドの当該領域のアミノ酸残基の数が低下している。
【0045】
本明細書で使用される用語「天然のセリンプロテアーゼポリペプチド」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、より好ましくはヒトにおいて自然に生じる内因性セリンプロテアーゼポリペプチドを指す。
【0046】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸組成」は、アミノ酸配列及び一続きの長さのアミノ酸残基を指すものであり、その長さは、その一続きの長さにおけるアミノ酸残基の数によって決定される。
【0047】
1つ又は複数のアミノ酸残基の挿入、置換及び/又は欠失、好ましくは挿入は、当業者に周知の組換えDNA技術を用いて行うことができる。例えば、当業者は、合成DNA、PCR技術及び分子クローニングを使用して、本発明のタンパク質をコードするDNA配列を有する組換えDNA構築物を得ることができる。適切な方法及び手段は、Green and Sambrook、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、CSHL Press、2012に記載されている。
【0048】
本明細書中で使用される用語「外表面ペプチド構造」は、連続的な一続きのアミノ酸残基を指し、折りたたまれた天然のトロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドの外部に出現するペプチドループ又はコイルとも呼ばれる。好ましくは、ペプチド構造は、トロンビンに関して、配列番号1のGly-427とAsp-462の間、好ましくはHis-450とAsp-462の間、より好ましくはHis-450とLeu-459の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域;凝固因子XIaに関して、配列番号2のVal-463とAsp-480の間、好ましくはHis-469とAsp-480又はSer-477の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域;トリプシンに関して、配列番号3のLeu-73とAsp-107の間、好ましくはHis-96とAsp-107又はLeu-104の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域;及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4のVal-237とAsp-275、好ましくはPhe-254又はVal-256とAsp-275又はAsn-274の間、より好ましくはHis-262とAsp-275又はAsn-274の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域である。
【0049】
前記外表面ペプチド構造中の、好ましくは、上に示される及び図2〜図4に示される、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドの領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入により、セリンプロテアーゼ阻害剤、好ましくは、直接的なトロンビン、凝固因子XIa、トリプシン又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤による阻害に対する感受性が低下したタンパク質がもたらされることが見出された。
【0050】
「の間のアミノ酸残基の領域に対応する」という語句は、例えば配列番号1のHis-450とAsp-462又はLeu-459との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域に関しては、配列番号1のHis-450及びAsp-462又はLeu-459に対応する別のトロンビンの保存されたHis及びAsp残基の残基番号が、配列番号1における前記His及びAsp残基に起因する残基番号とは異なることがあることを指し示すものとして本明細書中に用いられる。アミノ酸残基番号の違いは、例えば、アミノ酸残基の番号付けの異なる方法の結果であり得る。また、一例として、アミノ酸残基番号の違いは、配列番号1に示すヒトプロトロンビンポリペプチドの長さと比較したプロトロンビンポリペプチドの長さの違いの結果であり得る。同様に、異なる種の複数のプロトロンビンポリペプチドを整列する場合、当業者は容易に了承するであろうように、配列番号1のアミノ酸残基Gly-427は、異なる種のプロトロンビンポリペプチドの間で保存される。それゆえ、異なる種のセリンプロテアーゼ中の前記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定することができる。したがって、当業者は、本明細書で適用されるアミノ酸残基番号付けは本発明を限定するものではなく、明瞭化の目的にのみ適用されることを理解する。
【0051】
当業者は、本明細書に記載の領域に隣接する配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4の前記保存されたアミノ酸残基の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域をどのようにして同定するかを知っている。当業者は、例えば、配列番号1のHis-450及びAsp-462が、高度に保存された残基であり、これが他の種のセリンプロテアーゼポリペプチドにも存在することを直接的に確立する。
【0052】
非ヒトセリンプロテアーゼポリペプチド中の配列番号1のHis-450及びAsp-462の中並びにその付近、又は対応するHis及びAsp残基の中並びにその周辺のアミノ酸残基の領域の高度に保存された性質のために、当業者は、配列番号1のHis-450とAsp-462との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域を同定することができる。同じ一般原則が、本明細書に記載の領域に隣接する他のアミノ酸残基に適用される。換言すれば、特定のアミノ酸残基の保存された性質は、当業者に、どのアミノ酸残基が、非ヒトセリンプロテアーゼポリペプチドにおける本明細書中に定義されたような領域に含まれるかに関する明白な指針を与える。本明細書に具体的に記載される領域に隣接するアミノ酸残基は、種の間で保存されることが見出され、したがって、領域を定義するため適切である。
【0053】
当業者は、本発明が、(i)トロンビンに関して配列番号1の、Gly-427とAsp-462の間、好ましくはHis-450とAsp-462の間、より好ましくはHis-450とLeu-459の間、(ii)凝固因子XIaに関して配列番号2の、Val-463とAsp-480の間、好ましくはHis-469とAsp-480又はSer-477の間、(iii)トリプシンに関して配列番号3の、Leu-73とAsp-107の間、好ましくはHis-96とAsp-107又はLeu-104の間及び(iv)ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4の、Val-237とAsp-275の間、好ましくはPhe-254又はVal-256とAsp-275又はAsn-274の間、より好ましくはHis-262とAsp-275又はAsn-274の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域のアミノ酸組成にとりわけ関することを理解する。したがって、当業者は、本発明のタンパク質の残りのアミノ酸配列を、前記タンパク質がセリンプロテアーゼ阻害剤、好ましくは、直接的なトロンビンタイプ、凝固因子XIaタイプ、トリプシンタイプ、又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤に対する感受性が低下したセリンプロテアーゼポリペプチドのままである、又はこうしたセリンプロテアーゼポリペプチドへと活性化することができるという条件の下で、変更することができることを理解する。したがって、本発明のタンパク質の前記残りは、例えば、本発明のタンパク質を異なる種のセリンプロテアーゼポリペプチドの間で変更するのに応じて、変更し得る。
【0054】
本発明による領域に対応する領域中のアミノ酸残基の数は、異なる種の、特に哺乳類の群又は霊長類の群に属する種の間のセリンプロテアーゼポリペプチドの間で保存されている。したがって、アミノ酸残基の数は、セリンプロテアーゼポリペプチドにおいても保存されている。配列番号1のGly-427とAsp-462との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域中の前記保存されたアミノ酸残基の数は、Gly-427及びAsp-462は含まず、34である。配列番号1のHis-450とAsp-462との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域中の前記保存されたアミノ酸残基の数は、His-450及びAsp-462は含まず、11である。配列番号2、3及び4に関して、同じ原則が適用される。
【0055】
本発明のタンパク質において、本明細書中に定義されたような領域に対応するアミノ酸残基の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入により、セリンプロテアーゼ阻害剤による阻害に対する感受性が低下しているにもかかわらず、触媒的に活性なセリンプロテアーゼポリペプチドを生じることが見出された。
【0056】
好ましくは、挿入は、本明細書中に定義されたようなアミノ酸残基の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の置換と組み合わされている。
【0057】
挿入が1〜50個、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜30個、及び最も好ましくは1〜20個のアミノ酸残基を含む本発明のタンパク質が特に好ましい。挿入が、好ましくは、トロンビンに関して配列番号1のHis-450とAsp-462又はLeu-459、凝固因子XIaに関して配列番号2のHis-469とAsp-480又はSer-477、トリプシンに関して配列番号3のHis-96とAsp-107又はLeu-104或いはウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4のHis-262とAsp-275、Asn-274又はAla-271の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個、より好ましくは4又は5個のアミノ酸残基を含む又はからなる。トロンビンに関して配列番号1の、少なくとも4個のアミノ酸残基の挿入、例えば、His-450とAsp-462又はLeu-459の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域における8個のアミノ酸残基の挿入が特に好ましい。また、凝固因子XIaに関して配列番号2の、少なくとも5個のアミノ酸残基の挿入、例えば、His-469とAsp-480又はSer-477の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域における9個のアミノ酸残基の挿入が特に好ましい。また、トリプシンに関して配列番号3の、少なくとも5個のアミノ酸残基の挿入、例えば、His-96とAsp-107又はLeu-104の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域における9又は11個のアミノ酸残基の挿入が特に好ましい。また、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4の、少なくとも3個のアミノ酸残基の挿入、例えば、His-262とAsp-275、Asn-274又はAla-271の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域における7個のアミノ酸残基の挿入が特に好ましい。当業者は、アミノ酸残基が、本明細書中に定義されたようなアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域における任意の位置に挿入され得ることを理解する。挿入に適したアミノ酸残基は、Table 1(表1)に列挙される20個の自然に生じるアミノ酸残基の群から選択される。当業者は、前記挿入されたアミノ酸残基がin vivo又はin vitroで翻訳後化学変化を受け得ることを理解する。本明細書中の上記に示したように、当業者は、本明細書中に定義されたような領域に対応するアミノ酸残基の領域に1〜50個の間のアミノ酸残基の挿入を含む本発明のタンパク質をコードするDNA配列を有する組換えDNA構築物を得るよう、合成DNA、PCR技術及び分子クローニングを使用することができる。
【0058】
アミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域における挿入は、好ましくは、トロンビンに関して配列番号1のTrp-455とArg-456の間;凝固因子XIaに関して配列番号2のMet-474とAla-475の間;トリプシンに関して配列番号3のAsp-100とArg-101の間、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4のThr-269とLeu-270の間、又は非ヒトトロンビン、凝固因子XIa、トリプシン又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドにおけるこれらのアミノ酸残基に対応する2つのアミノ酸残基の間である。
【0059】
1〜30個、好ましくは1〜8個のアミノ酸残基の置換と組み合わされている、少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を含む本発明のタンパク質が特に好ましい。前記置換は、好ましくは、1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30個、好ましくは5〜8個のアミノ酸残基を含む又はそれからなる。トロンビンに関して配列番号1の、His-450とAsp-462又はLeu-459の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸残基の置換は、好ましくは、7又は8個のアミノ酸残基を含む又はからなる。凝固因子XIaに関して配列番号2の、His-469とAsp-480又はSer-477の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸残基の置換は、好ましくは、5又は6個のアミノ酸残基を含む又はからなる。トリプシンに関して配列番号3の、His-96とAsp-107又はLeu-104の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸残基の置換は、好ましくは、7個のアミノ酸残基を含む又はからなる。ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4の、His-262とAsp-275の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸残基の置換は、好ましくは、4又は7個のアミノ酸残基を含む又はからなる。
【0060】
本発明のタンパク質の本明細書中に定義されたような領域に対応する領域に存在するアミノ酸残基は、Table 1(表1)に列挙されるアミノ酸残基のいずれか1つで置換されていることが好ましく、Table 1(表1)の「側鎖の極性」及び「側鎖の電荷」の欄に、同じ群に属すると示されているアミノ酸によって置換されていることが好ましい。好ましくは、配列番号1の451〜455及び456〜458の1つ又は複数のアミノ酸残基;配列番号2の470〜474及び475〜476の1つ又は複数のアミノ酸残基;配列番号3の97〜100及び101〜103の1つ又は複数のアミノ酸残基;配列番号4の262〜269及び270〜274の1つ又は複数のアミノ酸残基、或いは非ヒトセリンプロテアーゼにおけるそれらの対応するアミノ酸残基は、Table 1(表1)に示されるアミノ酸残基から選択される異なるアミノ酸残基によって置換される。
【0061】
当業者は、本発明の非ヒトセリンプロテアーゼの本明細書中に定義されたような領域に対応するアミノ酸残基の領域においてアミノ酸残基が置換される場合、本発明の好ましいタンパク質に既に存在してはいないアミノ酸残基のみが好ましくは置換されることを理解する。当業者であれば、上記の配列番号の言及は、アミノ酸残基の特定の領域におけるアミノ酸残基の置換を例示する状況においてなされているにすぎないことが分かる。したがって、当業者は、他のアミノ酸残基又は残基について、非ヒトセリンプロテアーゼにおいて1つ又は複数のアミノ酸残基を置換し得るとの見込み(indication)を有する。本発明は、前述の挿入及び置換の可能な全ての組み合わせを対象とする。
【0062】
本発明のタンパク質は、本明細書中に定義されたような領域に対応するアミノ酸残基の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失を更に含んでもよい、但し、天然のセリンプロテアーゼポリペプチドのその領域におけるアミノ酸残基の数を比較する場合、少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入及び少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失の後の前記領域におけるアミノ酸残基の総数は、増加する。特に好ましいのは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20又は30個のアミノ酸残基の欠失を有する本発明のタンパク質である。
【0063】
本発明の好ましいタンパク質は、挿入及び置換の組み合わせ、或いは挿入、置換及び/又は欠失の組み合わせを含む。挿入及び欠失は、互いに独立して起こり得るので、例えば、本明細書中に定義されたようなアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域において、異なるアミノ酸位置に5アミノ酸残基の挿入及び4アミノ酸の欠失が存在し、これにより、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチド中のアミノ酸残基の総数を増加させることが可能である。当業者は、挿入又は欠失がタンパク質中のアミノ酸残基の番号付けを変化させることを理解する。
【0064】
最も好ましくは、本発明のタンパク質は、トロンビンに関して配列番号1のアミノ酸残基His-450とAsp-462の間又は非ヒトトロンビンに関して配列番号1のHis-450及びAsp-462に対応するアミノ残基の間に、配列番号5、配列番号6、配列番号13、配列番号14、配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の領域を含む。
【0065】
最も好ましくは、本発明のタンパク質は、凝固因子XIaに関して配列番号2のアミノ酸残基His-469とAsp-480の間又は非ヒト凝固因子XIaに関して配列番号2のHis-469及びAsp-480に対応するアミノ残基の間に、配列番号7又は配列番号8のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の領域を含む。
【0066】
最も好ましくは、本発明のタンパク質は、トリプシンに関して配列番号3のアミノ酸残基His-96とAsp-107の間又は非ヒトトリプシンに関して配列番号3のHis-96及びAsp-107に対応するアミノ残基の間に、配列番号9又は配列番号10のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の領域を含む。
【0067】
最も好ましくは、本発明のタンパク質は、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4のアミノ酸残基His-262とAsp-275の間又は非ヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関して配列番号4のHis-262及びAsp-275に対応するアミノ残基の間に、配列番号11又は配列番号12のアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の領域を含む。
【0068】
本発明は、本発明のタンパク質と実質的に相同及び生物学的に同等であるタンパク質も包含する。本発明のタンパク質は、好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に対して;又はその活性化形態に対して、90%を超えて相同性であるアミノ酸配列を有し、前記タンパク質は、触媒活性又はプロセシング/活性化後に触媒活性であり、セリンプロテアーゼ阻害剤、好ましくは、直接的なトロンビンタイプ、凝固FXIaタイプ、トリプシンタイプ、又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤に対して感受性が低下している。
【0069】
本発明の代替タンパク質は、配列番号1のIle-542に対応するアミノ酸残基位置にアミノ酸残基の置換又は置き換えを有するセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組換えタンパク質であり、ここで、セリンプロテアーゼポリペプチドは、凝固因子Xポリペプチド又はその自然でプロセシングされる若しくは活性化される形態ではない。例えば、当業者は、配列番号1のIle-542位が、配列番号2のHis-552位、配列番号3のGly-177位、及び配列番号4のSer-353位に対応することを認識する。当業者は、代替セリンプロテアーゼポリペプチドにおいて配列番号1のIle-542、配列番号2のHis-552、配列番号3のGly-177、又は配列番号4のSer-353に対応するアミノ酸残基位置を識別することは困難ではない。好ましくは、置換は、配列番号1のIle-542、配列番号2のHis-552位、配列番号3のGly-177位、又は配列番号4のSer-353位のアミノ酸残基位置にある。置換又は置き換えは、変異、好ましくは、保存又は非保存変異である。好ましくは、置換物としてのアミノ酸残基は、Table 1(表1)に示されるアミノ酸残基のいずれか1つであり得る。より好ましくは、置換物としてのアミノ酸残基は、アラニン、セリン、フェニルアラニン又はグルタミン酸である。好ましくは、セリンプロテアーゼポリペプチドは、(プロ)トロンビンである。このセクションに記載されるタンパク質におけるアミノ酸残基置換は、本明細書に記載される任意の挿入と組み合わせることができる。
【0070】
本発明の文脈において使用される用語「セリンプロテアーゼ阻害剤に対する感受性の低下」又は「セリンプロテアーゼ阻害剤による阻害に対する感受性の低下」は、最大阻害の50%(Ki)を得るために必要とされるセリンプロテアーゼ阻害剤の濃度を指す。この濃度は、天然のセリンプロテアーゼポリペプチドよりも本発明のポリペプチドに対してより高い。前記天然のセリンプロテアーゼポリペプチドは、好ましくは、血漿に由来する又は組換え生産される。セリンプロテアーゼ阻害剤のKiは、好ましくは、本発明のタンパク質を0.001から100μMのセリンプロテアーゼ阻害剤とプレインキュベートし、引き続いて触媒活性をアッセイする実験を行うことによって決定される。
【0071】
本発明のタンパク質のKiは、前記天然のセリンプロテアーゼポリペプチドのKiと比較して、本明細書中に定義されたようなアミノの領域に対応するアミノ酸残基の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を伴わずに、好ましくは2倍以上増加、より好ましくは50倍から100倍増加、最も好ましくは100倍以上増加する。
【0072】
本発明は更に、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、好ましくはDNA配列を含む核酸分子を提供する。当業者は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列をどのように生成するか、並びに、一般的に知られている組換えDNA技術を用いて前記DNA配列を有する核酸分子をどのように製造及び単離するかを、理解する。核酸分子の配列は、好ましくは、本発明の宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。このようにして、特定の宿主細胞における高発現に好ましいコドンが使用される。
【0073】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0074】
核酸分子は、好ましくは、当業者に公知の組換えDNA技術を用いて発現ベクターに挿入される。本発明の文脈において、発現ベクターは、宿主細胞中で本発明のタンパク質の発現を導く。これらの発現ベクターは、エピソームとして、又は染色体DNAの一部として、宿主細胞において複製可能であることが好ましい。更に、発現ベクターは、好ましくは、(i)CMV又はSV40プロモーター等の強力なプロモーター/エンハンサー、(ii)リボソーム結合部位及び開始コドン等の最適な翻訳開始配列、好ましくはKOZAKコンセンサス配列、及び(iii)転写終結配列、タンパク質が真核細胞中で発現される場合、ポリ(A)シグナルを含む。適切な発現ベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びレトロウイルス等のプラスミド及びウイルスベクターが含まれる。当業者は、使用される発現ベクターが、組換えタンパク質の発現に使用される宿主細胞に依存することを理解する。本発明の発現ベクターは、好ましくは細菌細胞を含む原核細胞における、又は、より好ましくは酵母細胞及び哺乳動物細胞等の真核生物宿主細胞における本発明の核酸分子の発現に適している。哺乳動物発現ベクターpCMV4が特に好ましい。
【0075】
代替案として、本発明の核酸分子は、宿主細胞のゲノムに挿入することができる。前記挿入は、好ましくは、宿主細胞における本発明の核酸分子の発現を確実にする遺伝子座に又は領域内にある。
【0076】
本発明は、本発明による核酸分子又は発現ベクターを含む宿主細胞を更に提供する。本発明は、好ましくは、本発明の核酸分子を発現し、それによって本発明のタンパク質を産生する宿主細胞を提供する。前記タンパク質は、宿主細胞内で産生されるか、又は好ましくは宿主細胞から分泌される。
【0077】
本発明での使用に適した宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、サル細胞及びヒト細胞等の原核細胞及び真核細胞を含む。適切な真核生物宿主細胞の例は、限定されるものではないが、HEK293細胞、ハムスター細胞株CHO及びBHK-21;ネズミ宿主細胞NIH3T3、NSO及びC127;サルの宿主細胞COS及びVero;ヒト宿主細胞HeLa、PER.C6、U-937及びHepG2が含まれる。適切な細胞は、ATCC等の公的供給源及びLife Technologiesから入手可能である。いくつかのトランスフェクション技術が当技術分野において公知であり、例えば、Graham et al.、1973. Virology 52: 456頁;Green et al.、2012.「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、CSHL Press;Davis et al.、「Basic Methods in Molecular Biology」、1986、Elsevier; and Chu et al.、1981. Gene 13: 197を参照されたい。当業者は、好ましくは、これらの参考文献に記載の技術を用いて、1つ又は複数の外因性核酸分子を適切な宿主細胞に導入する。
【0078】
本発明のタンパク質の産生のための特に好ましい宿主細胞は、HEK293細胞である。
【0079】
本発明は、本発明のタンパク質及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を更に提供する。本発明の医薬組成物は、好ましくは、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、及び当該分野で公知の他の材料のうちの1つ又は複数を含む。担体の特性は、当業者に知られているように、投与経路に依存する。活性化セリンプロテアーゼポリペプチドを投与する潜在的な血栓症リスクを低減するため、本発明の医薬組成物は、好ましくは、対象に投与した後に活性化される本発明のタンパク質を含む。
【0080】
「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトの群を意味する。
【0081】
「医薬組成物」との用語は、本発明の文脈において、組成物をin vivo又はex vivoでの治療的使用に適したものにする、本発明のタンパク質と、不活性又は活性の担体との組み合わせを意味する。
【0082】
本明細書で使用する「薬学的に許容される」との用語は、本発明のタンパク質の物理的及び化学的特徴と適合性を有し、前記タンパク質の生物学的活性の有効性を干渉しない非毒性物質であることを指す。
【0083】
本発明の医薬組成物は、消化管、例えば経口摂取又は直腸投与によって吸収される、組成物の経腸投与に適合させることができる。前記組成物は、好ましくは、タンパク質分解を防ぐよう、例えばリポソームによってカプセル化される。
【0084】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、組成物が静脈内、動脈内、皮下、及び/又は、筋肉内に導入される非経口投与に適合される。非経口投与は、本発明の医薬組成物の、体組織又は体液への注射又は点滴が関与し、好ましくは、注射器、針又はカテーテルが使用される。代替案として、針なしの高圧投与を非経口投与のための手段として使用することができる。
【0085】
注射用組成物(例えば、静脈内用組成物)について、担体は、水性若しくは油性溶液、分散液、乳濁液、及び/又は、懸濁液であってもよい。好ましくは、担体は、水溶液、好ましくは、蒸留滅菌水、生理食塩水、緩衝食塩水、又は、注射用の他の薬学的に許容される賦形剤である。
【0086】
トロンビン又は凝固因子XIaである本発明のタンパク質を含む本発明の医薬組成物は、局所的に、例えば創傷部若しくはその中に、又は、創傷領域に血液を供給する血管、好ましくは動脈に適用することができる。前記局所投与は、例えばクリーム、泡、ゲル、ローション又は軟膏の形態の局所投与、又は、例えば注射又は点滴による非経口投与であり、局所又は全身の治療効果を生じる。局所効果に対する本発明のタンパク質の局所投与は、潜在的な全身性血栓症の危険性を低下させる。
【0087】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、様々な治療用途に使用される。例えば、トロンビン又は凝固因子XIaである本発明のタンパク質を含む医薬組成物は、血友病A及びB、血友病A及びB阻害剤患者群等の、正常な血液凝固が損なわれている障害の治療又は改善においてバイパス剤として使用することができる。血友病A及びB阻害剤患者は、出血の発症を治療又は防止するために使用される産物を対象とする抗体を発生させた患者である。
【0088】
したがって、本発明は、医薬として使用するための、本発明によるタンパク質又は医薬組成物も提供する。
【0089】
本発明は、対象における凝固阻害剤の抗凝固作用を完全に又は部分的に逆転させる方法における使用のための、本発明によるトロンビン又は凝固因子XIaポリペプチドを含む本発明によるタンパク質又はトロンビン又は凝固因子XIaポリペプチドを含む本発明による医薬組成物を更に提供する。
【0090】
「抗凝固作用」という用語は、凝固阻害剤の作用の結果である血液凝固の防止等の治療効果を指す。
【0091】
本発明は、対象における凝固阻害剤の抗凝固作用を完全に又は部分的に逆転させる医薬の製造のための、トロンビン又は凝固因子XIaポリペプチドを含む本発明のタンパク質の使用を更に提供する。
【0092】
本発明は、対象における凝固阻害剤の抗凝固作用を完全に若しくは部分的に回復させる方法を更に提供し、前記方法は、治療有効量の、トロンビン若しくは凝固因子XIaポリペプチドを含む本発明のタンパク質又はトロンビン若しくは凝固因子XIaポリペプチドを含む本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。好ましくは、本発明の方法は、抗凝固療法に関連する出血合併症を防止又は改善するために適用される。
【0093】
本明細書で使用される用語「治療有効量」は、投与される医薬組成物に含有される活性成分の量が、意図される目的を達成するのに十分な量であり、とりわけ、この場合、凝固阻害剤の抗凝固作用を完全に又は部分的に逆転させることを意味する。本発明による医薬組成物中の活性成分、すなわち本発明のタンパク質の量は、好ましくはタンパク質の約5mg〜約10グラムの範囲である。
【0094】
治療有効量は、本発明のタンパク質を必要とする人物の血液中のタンパク質の平均濃度に依存し得る。例えば、治療有効量は、(i)本発明によるトロンビンの好ましくは5mg〜10gの間、好ましくは150mg〜10グラムの間;(ii)本発明による凝固因子XIaの5mg〜600mg、好ましくは5mg〜300mg;(iii)本発明によるトリプシンの100マイクログラム〜7mg;及び(iv)本発明によるウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの0.004mg〜0.3mgである。当業者は、本発明によるタンパク質の各々の量が異なることがあることを理解する。その理由は、これらのタンパク質の正常な血漿又は血清レベルは異なるからである。
【0095】
本発明のトロンビン又は凝固因子XIaポリペプチドを含む本発明のタンパク質を含む本発明による医薬組成物は、好ましくは、凝固阻害剤の抗凝固作用の完全又は部分的逆転を必要とする対象に、1回、2回又は3回のみ、好ましくは1回のみ投与される。
【0096】
本発明は、対象におけるトリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を完全に又は部分的に逆転させる方法における使用のための、本発明のトリプシンポリペプチドを含む本発明のタンパク質又は本発明のトリプシンポリペプチドを含む本発明のタンパク質を含む本発明の医薬組成物を更に提供する。
【0097】
同じ文脈において、本発明は、対象におけるトリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を完全に又は部分的に逆転させる方法を提供し、前記方法は、治療有効量の、本発明のトリプシンポリペプチドを含む本発明のタンパク質又は本発明のトリプシンポリペプチドを含む本発明のタンパク質を含む本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。好ましくは、対象は、本発明のタンパク質を投与する前に、トリプシン阻害剤で治療される。
【0098】
同じ文脈において、本発明は、対象におけるトリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を完全に又は部分的に逆転させる医薬の製造のための、本発明によるトリプシンポリペプチドを含む本発明のタンパク質の使用を提供する。
【0099】
本発明は、トリプシン阻害剤のペプチド結合加水分解の阻害を完全に又は部分的に逆転させることにおける、トリプシンポリペプチドを含む本発明のタンパク質の非治療的使用を更に提供する。
【0100】
本発明は、抗線維素溶解作用を完全に又は部分的に逆転させることに使用するための、本発明のウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータを含む本発明のタンパク質を更に提供する(好ましくは、前記抗線維素溶解作用は、対象におけるウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤等の阻害剤によって誘導される)。好ましくは、この状況では、抗線維素溶解作用は、好ましくは、血栓症、例えば、重篤若しくは大量の深部静脈血栓、肺塞栓症、心筋梗塞又は閉塞性静脈又は透析カニューレの状況では、血餅の崩壊の低下をもたらす。ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤はMesupronであることが更に好ましい。
【0101】
対象は、好ましくは、Mesupronで治療されたがん患者である。ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤、例えばMesupronは、転移に寄与する可能性がある、組織分解を防止するため、がん患者にしばしば投与される。しかしながら、Mesupron等のウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤の投与は抗線維素溶解作用をもたらし得、これを本発明による組換えウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータで処置することができる。
【0102】
本明細書に記載される他の投与経路に加えて、本発明のウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータは、例えば、複雑な胸水及び蓄膿のドレナージを改善するため、胸膜内投与に関して製剤化することができる。
【0103】
本発明は、同じ様式で、抗線維素溶解作用を完全に又は部分的に逆転させる医薬の製造のための、本発明のウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータを含む本発明のタンパク質を提供する(好ましくは、前記抗線維素溶解作用は、対象におけるウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤等の阻害剤によって誘導される)。
【0104】
本発明は、同じ様式で、抗線維素溶解作用を完全に又は部分的に逆転させる方法を提供し、好ましくは前記抗線維素溶解作用は対象におけるウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ阻害剤等の阻害剤によって誘導され、前記方法は、治療有効量の、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドを含む本発明のタンパク質又はウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータポリペプチドを含む本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む。好ましくは、本発明の方法は、抗線維素溶解性阻害剤療法に関連する血栓性合併症を防止又は改善するために適用される。
【0105】
或いは、本発明は、セリンプロテアーゼポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供し、前記ポリペプチドは外表面ペプチド構造中に少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を含み、ここで、セリンプロテアーゼポリペプチドは凝固因子Xポリペプチド、又はその触媒活性又は自然でプロセスされる形態、例えば、凝固因子Xaポリペプチドではない。
【0106】
好ましくは、前記ペプチド構造は、配列番号1のHis-450とAsp-462の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域である。この文脈において、用語「対応する」は、トロンビン及び非トロンビンセリンプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の領域を指すため使用される。或いは、セリンプロテアーゼポリペプチドは、トロンビン、凝固因子XIa、トリプシン及びウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータからなる群から選択され、ここで、外表面ペプチド構造は本明細書中に示される。
【0107】
本発明の文脈において、タンパク質は、それが(潜在的に)凝血促進剤セリンプロテアーゼである場合且つ前記タンパク質の完全長アミノ酸配列が、異なる種の凝固FX因子の間で保存されている一続きのアミノ酸残基(又は単独)に対応する一続きのアミノ酸残基(又は単独)を含む場合に、凝固FX又はFXaポリペプチドである。例えば、ヒト凝固因子X(vide Genbank Acc No. AAH46125.1)のアミノ酸残基Cys-246からAla-250、Phe-260からLeu-266及び/又はAsp-413からHis-423に対応する一続きのアミノ酸残基を含有するポリペプチドを含む凝血促進性セリンプロテアーゼは、凝固FXaポリペプチドであると推定される。以上の記載に示されるように、示されるHis及びAspアミノ酸残基は、異なるセリンプロテアーゼポリペプチドの間及び異なる種の間で保存される。
【0108】
明確化及び簡潔な説明の目的のために、特徴は、同じ又は別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解される。
【0109】
配列番号1(ヒト凝固プロトロンビンタンパク質)
1 mahvrglqlp gclalaalcs lvhsqhvfla pqqarsllqr vrrantflee vrkgnlerec
61 veetcsyeea fealesstat dvfwakytac etartprdkl aaclegncae glgtnyrghv
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481 vclpdretaa sllqagykgr vtgwgnlket wtanvgkgqp svlqvvnlpi verpvckdst
541 riritdnmfc agykpdegkr gdacegdsgg pfvmkspfnn rwyqmgivsw gegcdrdgky
601 gfythvfrlk kwiqkvidqf ge
【0110】
配列番号2(ヒト凝固因子XIタンパク質)
1 miflyqvvhf ilftsvsgec vtqllkdtcf eggdittvft psakycqvvc tyhprcllft
61 ftaespsedp trwftcvlkd svtetlprvn rtaaisgysf kqcshqisac nkdiyvdldm
121 kginynssva ksaqecqerc tddvhchfft yatrqfpsle hrnicllkht qtgtptritk
181 ldkvvsgfsl kscalsnlac irdifpntvf adsnidsvma pdafvcgric thhpgclfft
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301 flgeeldiva aksheacqkl ctnavrcqff tytpaqascn egkgkcylkl ssngsptkil
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541 tneecqkryr ghkithkmic agyreggkda ckgdsggpls ckhnevwhlv gitswgegca
601 qrerpgvytn vveyvdwile ktqav
【0111】
配列番号3(ヒトトリプシン-1タンパク質)
1 mnplliltfv aaalaapfdd ddkivggync eensvpyqvs lnsgyhfcgg slineqwvvs
61 aghcyksriq vrlgehniev legneqfina akiirhpqyd rktlnndiml iklssravin
121 arvstislpt appatgtkcl isgwgntass gadypdelqc ldapvlsqak ceasypgkit
181 snmfcvgfle ggkdscqgds ggpvvcngql qgvvswgdgc aqknkpgvyt kvynyvkwik
241 ntiaans
【0112】
配列番号4(ヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ)
1 mrallarlll cvlvvsdskg snelhqvpsn cdclnggtcv snkyfsnihw cncpkkfggq
61 hceidksktc yegnghfyrg kastdtmgrp clpwnsatvl qqtyhahrsd alqlglgkhn
121 ycrnpdnrrr pwcyvqvglk plvqecmvhd cadgkkpssp peelkfqcgq ktlrprfkii
181 ggefttienq pwfaaiyrrh rggsvtyvcg gslispcwvi sathcfidyp kkedyivylg
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301 psmyndpqfg tsceitgfgk enstdylype qlkmtvvkli shrecqqphy ygsevttkml
361 caadpqwktd scqgdsggpl vcslqgrmtl tgivswgrgc alkdkpgvyt rvshflpwir
421 shtkeengla l
【0113】
配列番号5
1 kkfvppqkay kfdlaaldr
【0114】
配列番号6
1 ppqkaykfdl aaldr
【0115】
配列番号7
1 kkfvppqkay kfdlaasgy
【0116】
配列番号8
1 ppqkaykfdl aasgy
【0117】
配列番号9
1 kkfvppqkay kfdlaalnn
【0118】
配列番号10
1 kkfvppsqef yekfdlvsln n
【0119】
配列番号11
1 kkfvppqkay kfdlaahhn
【0120】
配列番号12
1 ppqkaykfdl aahhn
【0121】
配列番号13
1 pryvppqkay kfdlaaldr
【0122】
配列番号14
1 tkfvppnyyy vhqnfdrval dr
【0123】
配列番号15
1 pkyhqgsgpi lprrtldr
【0124】
配列番号16
1 prydsissky lkellekpld r
【図面の簡単な説明】
【0125】
【図1】上部パネルは、ヒトプロトロンビン(配列番号1)におけるHis-450からAsp-462のアミノ酸残基の領域とヒトFXI(配列番号2)、ヒトトリプシン(配列番号3)及びヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ(配列番号4)における前記領域に対応するアミノ酸残基の領域とのアラインメントを示し、下部の3つのパネルは、ヒトプロトロンビンにおけるHis-450からAsp-462、ヒトFXIに関してHis-469とAsp-480の間、トリプシンに関してHis-96とAsp-107の間、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータに関してHis-262とAsp-275の間の前記領域に対応するアミノ酸残基の領域において挿入を有するヒトプロトロンビン、ヒトFXI、ヒトトリプシン及びヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータの新たに生成された「A」及び「B」タンパク質変異体を示す図である。保存された残基ヒスチジン及びアスパラギン酸は、強調表示される。
【図2】アルガトロバン-トロンビン複合体の結晶構造(PDB 1DWC)を示す図である。アルガトロバン-接触残基(His57、Tyr60A、Lys60F、Leu99、Ile174、Glu192、Ser195、Asp189、Glu192、Gly216、Gly218、Gly226;キモトリプシン番号付け(Bode、W. et al. 1989. EMBO J 8: 3467〜3475頁))並びに触媒性トライアッド残基His57、Ser195、及びAsp102をスティックとして示す。His91ループは、強調表示され、矢印で示される。
【図3】化合物33-FXIa複合体の結晶構造(PDB 4X6P)を示す図である。化合物33はスティックモデルで示され、FXIaは表面表示で示される。接触残基(His40、Leu41、Cys42、Cys58、Tyr58b、Tyr143、Ile151、Asp189、Lys192、Gly193、Asp194、Ser195、Gly216、Gly218、Tyr228;キモトリプシン番号付け(Bode、W. et al. 1989. EMBO J 8: 3467〜3475頁))、触媒性トライアッド残基His57、Ser195、及びHis91ループは、強調表示される。後者は、追加で矢印で示される。
【図4】メラガトラン-トリプシン複合体の結晶構造(PDB 1K1P)を示す図である。接触残基(Asp 189、Ser190、Gly216、及びGly21;キモトリプシン番号付け(Bode、W. et al. 1989. EMBO J 8: 3467〜3475頁))及び触媒性トライアッド残基His57、Ser195をスティックとして示す。His91ループは、強調表示され、矢印で示される。
【図5】ヒトプロトロンビン(「トロンビン」、配列番号1)におけるHis-450からAsp-462のアミノ酸残基の領域とプロトロンビンにおけるHis-450からAsp-462の前記領域に対応するアミノ酸残基の領域において挿入を有するヒトプロトロンビンの新たに生成されたタンパク質変異体(「ISO1」、「ISO2」、「NSC」、「KL10」、「ALB」)とのアラインメントを示す図である。450位での保存された残基ヒスチジン及び462位でのアスパラギン酸は、強調表示される。
【図6】直接的なトロンビン阻害剤ダビガトラン-シリーズ1による発色性トロンビン活性の阻害を示す図である。増加する濃度(20nM〜20μM)のダビガトランの存在下での、5nM血漿由来トロンビン(「IIa」;パネルA)、活性化血漿由来プロトロンビン(「pd-IIa」;パネルB)、組換えトロンビン(「r-IIa」;パネルC)、組換えトロンビン変異体ISO1(「ISO1」;パネルD)、又は組換えトロンビン変異体NSC(「NSC」;パネルE)による、ペプチジル基質変換(S-2238;100μM)。IC50濃度を、Graphpad Prismソフトウェアスイートを使用して、非線形回帰によるS-2238変換(mOD/min)のフィッティングによって得た。全てのデータポイントは、2つの独立した実験の平均を表す。パネルF:基質変換(速度)を、阻害剤の非存在下でのインキュベーションに対する比としてプロットした。変異体が対照よりも高い標準化速度を示すことがパネルF中に明確に示されている。
【図7】直接的なトロンビン阻害剤ダビガトラン-シリーズ2による発色性トロンビン活性の阻害を示す図である。増加する濃度(20nM〜20μM)のダビガトランの存在下での、5nM血漿由来トロンビン(「IIa」;パネルA)、組換えトロンビン(「r-IIa」;パネルB)、組換えトロンビン変異体ALB(「ALB」;パネルC)、組換えトロンビン変異体KL10(「KL10」;パネルD)、又は組換えトロンビン変異体ISO2(「ISO2」;パネルE)による、ペプチジル基質変換(S-2238;100μM)。IC50濃度を、Graphpad Prismソフトウェアスイートを使用して、非線形回帰によるS-2238変換(mOD/min)のフィッティングによって得た。全てのデータポイントは、2つの独立した実験の平均を表す。パネルF:基質変換(速度)を、阻害剤の非存在下でのインキュベーションに対する比としてプロットした。変異体が対照よりも高い標準化速度を示すことがパネルF中に明確に示されている。
【図8】ダビガトランとの複合体中のトロンビンの結晶構造(PDB 1KTS)(Hauel et al.、J Med Chem 45: 1757〜1766頁(2002)) を示す図である。活性部位残基His406、Asp462、及びSer568並びにダビガトラン相互作用残基Tyr410、Leu459、Ile542、Asp562、Trp590、及びGly591は、スティック図として示される。活性部位のS4サブポケットの位置が長円で印を付けられ、残基Ile542が示される。
【図9】直接的なトロンビン阻害剤ダビガトラン-シリーズ3による発色性トロンビン活性の阻害を示す図である。増加する濃度(20nM〜20μM)のダビガトランの存在下での、5nM血漿由来トロンビン(パネルA)、組換えトロンビン(パネルB)、組換えトロンビン変異体I542F(パネルC)、組換えトロンビン変異体I542A(パネルD)、組換えトロンビン変異体I542E(パネルE)、又は組換えトロンビン変異体I542S(パネルF)による、ペプチジル基質変換(S-2238;100μM)。IC50濃度を、Graphpad Prismソフトウェアスイートを使用して、非線形回帰によるS-2238変換(mOD/min)のフィッティングによって得た。全てのデータポイントは、2つの独立した実験の平均を表す。
【図10】直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランによる発色性トロンビン活性の標準化阻害を示す図である。増加する濃度(20nM〜20μM)のダビガトランの存在下での、5nM血漿由来トロンビン(「IIa」)、組換えトロンビン(「r-IIa」)、組換えトロンビン変異体I542A、組換えトロンビン変異体I542E、組換えトロンビン変異体I542F、又は組換えトロンビン変異体I542Sによる、ペプチジル基質変換(S-2238;100μM)。基質変換(速度)を、阻害剤の非存在下でのインキュベーションに対する比としてプロットした。全てのデータポイントは、2つの独立した実験の平均を表す。変異体が対照よりも高い標準化速度を示すことが明確に示されている。
【図11】ヒトプロトロンビン(「トロンビン」、配列番号1)におけるCys-536からCys-550、ヒトXI因子(「FXIa」、配列番号2)におけるCys-545からCys-560、ヒトトリプシン-1(「トリプシン」、配列番号3)におけるCys-171からCys-185、及びヒトウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ(「uPA」、配列番号4)におけるCys-345からCys-361のアミノ酸残基の領域のアラインメントを示す図である。残基Ile-542(配列番号1)、His-552(配列番号2)、Gly-177(配列番号3)、及びSer-353(配列番号4)は、強調表示される。
【発明を実施するための形態】
【0126】
【表1】
【実施例】
【0127】
(実施例1)
材料及び方法
材料:直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤はAlsachim及びAdooqから得られ、トウモロコシトリプシン阻害剤はHaematologic Technologiesから得られた。FXI枯渇及びプロトロンビン枯渇ヒト血漿(Neoplastin CIプラス10)並びにTriniCLOT自動化APTTは、Diagnostica Stagoから得られた。ペプチジル基質S-2238、S-2366、S-2444及びS-2222は、Chromogenixから得られた。Rocheから入手されるインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム(ITS)を除いて、全ての組織培養試薬はLife Technologiesから得られた。検量用試料(Calibrator)及び蛍光基質(FluCa)は、Thrombinoscope BVから得られた。75%(w/w)の鶏卵L-ホスファチジルコリン及び25%(w/w)のブタ脳L-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids)から構成される小型単層リン脂質ベシクル(PCPS)が調製され、以前に記載されているように特徴付けされた(Higgins et al. 1983. J Biol Chem 258: 6503〜6508頁)。一般的な組換えタンパク質の産生及び精製技術は、Green and Sambrook、Molecular Cloning、4th edition、July 2012に記載されているとおりである。
【0128】
トロンビンの発現及び精製:プロトロンビン変異体A(プロトロンビン(配列番号1)のHis-450とAsp-462の間に配列番号5のアミノ酸配列を有する)及びB(プロトロンビン(配列番号1)のHis-450とAsp-462の間に配列番号6のアミノ酸配列を有する)及び野生型プロトロンビンをコードするプラスミド(pcDNA3.1(+))は、LipofectAMINE 2000(Invitrogen)を使用してHEK293細胞に導入され、選択可能なマーカープラスミドとしてpSV2neoが使用された。高発現クローンが、本質的に記載(Orcutt et al. 2004. J Biol Chem 279: 54927〜54936頁)のように、プロトロンビン特異的なELISA及びPT凝固アッセイに基づいて選択された。選択されたクローンは、10-stacked cell factories(Nalge-Nunc、Naperville、IL)へと増殖させ、5μg/ml ITS及び10μg/mlビタミンKを補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地中で培養された。馴化培地が、5〜6日収集され、遠心分離され、1mMベンズアミジンの存在下で-20℃で保存された。プロトロンビンは、本質的に記載(Orcutt et al. 2004. J Biol Chem 279: 54927〜54936頁)のように、Q-セファロースFF(GE Healthcare)、HQ POROSマトリックス(Affinity Biologicals)、及びセラミックヒドロキシアパタイトマトリックス(Bio-Rad)を用いて、馴化培地から精製された。精製されたプロトロンビンは、50% vol/volグリセロールを含有するHBS中で-20℃で保存された。タンパク質純度は、還元条件下でプレキャスト4-12%勾配ゲル(Invitrogen)を使用するSDS-PAGEの後に、クーマシーブリリアントブルーR-250で染色することによって評価された。トロンビンは、記載(Lundblad et al.、1976. Methods Enzymol 45: 156〜176頁)のように、プロトロンビンの調製活性化後に精製された。
【0129】
FXIの発現及び精製:FXI変異体A(FXI(配列番号2)のHis-469とAsp-480の間に配列番号7のアミノ酸配列を有する)及びB(FXI(配列番号2)のHis-469とAsp-480の間に配列番号8のアミノ酸配列を有する)及び野生型FXIとそれらのC末端を介してHPC4-抗体認識配列(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGK)に融合して精製を促進させたものをコードするプラスミド(pcDNA3.1(+))は、LipofectAMINE 2000(Invitrogen)を使用してベビーハムスター腎臓(BHK)細胞に導入され、選択可能なマーカープラスミドとしてpSV2neoが使用された。高発現クローンが、本質的にV因子についての記載(Toso et al. 2004. J Biol Chem 279: 21643〜21650頁)のように、FXI特異的なELISA及びAPTT凝固アッセイに基づいて選択された。選択されたクローンは、トリプルフラスコ(Nalge-Nunc、Naperville、IL)へと増殖させ、5μg/ml ITS及び1.0mg/ml Albumax(Invitrogen)を補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地中で培養された。馴化培地が5〜6日収集され、遠心分離され、1mMベンズアミジンの存在下で-20℃で保存された。馴化培地は、37℃で解凍され、プールされ、25mM Tris、0.05M NaCl、5mM CaCl2、pH7.4で平衡化された抗-HPC4セファロースカラムにロードされた。カラムは、平衡化緩衝液で洗浄され、次に25mM Tris、0.5M NaCl、5mM EDTA、pH7.4で溶出され、続いて25mM Tris、2M NaCl、5mM EDTA、pH7.4で溶出された。FXI活性を含有する画分は、プールされ、20mM Hepes、150mM NaCl、pH7.4に対して透析され、限外濾過(Millipore)によって濃縮され、精製されたタンパク質は-80℃で保存された。タンパク質純度は、還元条件下でプレキャスト4-12%勾配ゲル(Invitrogen)を使用するSDS-PAGEの後に、クーマシーブリリアントブルーR-250で染色することによって評価された。XIa因子は、記載(Ogawa et al.、2005. J Biol Chem 280: 23523〜23530頁)のように、FXIの調製活性化後に精製された。
【0130】
ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ(uPA)の発現及び精製:ヒトuPA変異体A(uPA(配列番号4)のHis-262とAsp-275の間に配列番号11のアミノ酸配列を有する)及びB(uPA(配列番号4)のHis-262とAsp-275の間に配列番号12のアミノ酸配列を有する)並びに野生型uPAとそれらのC末端を介してHPC4-抗体認識配列(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGK)に又はHis-タグ(6His:HHHHHH又は12His:HHHHHHHHHHHH)に融合して精製を促進させたものをコードするプラスミド(pcDNA3.1(+))は、LipofectAMINE 2000(Invitrogen)を使用して哺乳動物細胞(HEK293及びBHK)に導入され、選択可能なマーカープラスミドとしてpSV2neoが使用された。高発現クローンが、ヒトuPA-特異的ELISA(R&D Systems)に基づいて選択された。選択されたクローンは、トリプルフラスコ(Nalge-Nunc、Naperville、IL)へと増殖させ、5μg/ml ITS及び1.0mg/ml Albumax(Invitrogen)を補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地中で培養された。馴化培地が5〜6日収集され、遠心分離され、1mMベンズアミジンの存在下で-20℃で保存された。
【0131】
馴化培地は、37℃で解凍され、プールされ、本質的にFXI変異体についての記載のように、抗-HPC4セファロースを使用して精製された。或いは、His-タグを付けたuPA変異体は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて使用して精製された。精製されたタンパク質は-80℃で保存され、タンパク質純度は還元条件下でプレキャスト4-12%勾配ゲル(Invitrogen)を使用するSDS-PAGEの後に、クーマシーブリリアントブルーR-250で染色することによって評価された。uPA変異体はヒトプラスミンによって活性化され、ベンズアミジン-セファロースを用いて精製された。
【0132】
トリプシンの発現及び精製:ヒトトリプシノーゲン-1変異体A(トリプシン(配列番号3)のHis-96とAsp-107の間に配列番号9のアミノ酸配列を有する)及びB(トリプシン(配列番号3)のHis-96とAsp-107の間に配列番号10のアミノ酸配列を有する)並びに野生型トリプシン(配列番号3)(ここで、リーダー配列は修飾されて、トリプシン様酵素切断部位が欠失させられている(特許EP1141263 A1を参照されたい))とそれらのC末端を介してHPC4-抗体認識配列(アミノ酸配列EDQVDPRLIDGK)に又はHis-タグ(6His:HHHHHH又は12His:HHHHHHHHHHHH)に融合して精製を促進させたものをコードするプラスミド(pcDNA3.1(+))は、LipofectAMINE 2000(Invitrogen)を使用してHEK293細胞に導入され、選択可能なマーカープラスミドとしてpSV2neoが使用された。高発現クローンが、ヒトトリプシノーゲン特異的ELISA(MyBioSource)に基づいて選択された。選択されたクローンは、トリプルフラスコ(Nalge-Nunc、Naperville、IL)へと増殖させ、5μg/ml ITS及び1.0mg/ml Albumax(Invitrogen)を補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地中で培養された。馴化培地が5〜6日収集され、遠心分離され、1mMベンズアミジンの存在下で-20℃で保存された。
【0133】
馴化培地は、37℃で解凍され、プールされ、本質的にFXI変異体についての記載のように、抗-HPC4セファロースを使用して精製された。或いは、His-タグを付けたトリプシノーゲン変異体は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。精製されたタンパク質は-80℃で保存され、タンパク質純度は還元条件下でプレキャスト4-12%勾配ゲル(Invitrogen)を使用するSDS-PAGEの後に、クーマシーブリリアントブルーR-250で染色することによって評価された。トリプシン-1変異体は、トリプシノーゲン-1変異体のエンテロキナーゼ依存的な切断から調製され、SP-又はベンズアミジン-セファロースを用いて精製された。
【0134】
(実施例2)
直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤によるセリンプロテアーゼの阻害。
最初に、ペプチジル基質加水分解(それぞれトロンビン、FXIa、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ又はトリプシンに対する特異的な基質としてS-2388、S-2366、S-2444又はS-2222)の動態が、上記のトロンビン、FXIa、ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ又はトリプシン変異体及び野生型の存在下で、増加する濃度の基質(10〜500μM)を使用して測定された。セリンプロテアーゼを結合及び阻害する直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤の能力は、固定濃度(Kmで又はKmを超える)のペプチジル基質及び酵素で、増加する濃度の直接的な阻害剤(1nM〜10μM)を使用して、ペプチジル基質加水分解の初速度測定による古典的な競合阻害を推定する阻害定数(Ki)を評価することによって試験された。全ての動力学的な測定は、20mM Hepes、0.15M NaCl、0.1%(w/v)ポリエチレングリコール8000、2mM CaCl2、pH7.5で行われた。
【0135】
(実施例3)
トロンビン生成アッセイ。
トロンビン生成は、以前に記載されたプロトコール(Hemker et al.、2003. Pathophysiol Haemost Thromb 33: 4〜15頁)に適合させた。簡単に述べると、トロンビン生成曲線が、プロトロンビン-又はFXI-欠損血漿とともにトウモロコシトリプシン阻害剤(70μg/ml)、PCPS(20μM)及び基質緩衝剤(Fluca)を補充することによって得られた。トロンビン形成は、直接的なセリンプロテアーゼ阻害剤と予め混合した、1単位(凝固比活性)のトロンビンA又はB変異体、FXIa A又はB変異体、及び野生型トロンビン又はFXIaの添加によって開始された。代替セットアップにおいて、タンパク質変異体の酵素前駆体形態が、評価された。そのため、プロトロンビン-又はFXI-枯渇血漿は、それぞれ、組織因子(TF(Innovin)、2又は20pM最終)、トウモロコシトリプシン阻害剤(70μg/ml)、PCPS(20μM)、直接的な阻害剤、及び1単位(凝固比活性)の組換えプロトロンビン又はFXI変異体を補充された。トロンビン形成は、血漿へのFlucaの添加によって開始された。トロンビン形成は、20秒ごとに30分間決定され、Thrombinoscopeソフトウェア(Thrombinoscope BV)を使用して較正のため補正された。遅延時間、平均内因性トロンビンポテンシャル(トロンビン生成曲線下の面積)、ピークまでの時間及びピークトロンビン生成は、少なくとも3つの個々の実験から計算された。
【0136】
(実施例4)
ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ変異体についての血餅溶解時間評価。
血餅溶解時間は、以前の記載(Mosnier et al.、2001. Thromb Haemost 86: 1035〜1039頁)のように、基本的に評価された。簡単に述べると、組織因子(TF、Innovin)及びPCPSは、37℃で1時間、25mM Hepes、137mM NaCl、3.5mM KCl、0.1% BSA、pH7.4中でインキュベートされた。TF/PCPS混合物(0.5pM/20μM最終)は、血漿(50% v/v)、tPA(150U/ml最終)、及びCTI(70μg/ml最終)で10分間、37℃でインキュベートされた。凝固は、37℃でプレインキュベートされたCa2+(17mM最終)で開始された。血餅形成及び引き続く溶解は、SpectraMax M2eマイクロプレートリーダーにおいて吸光度405nmで4時間、37℃で測定することによってモニターされた。血餅溶解時間は、GraphPadプリズム5を使用して濁度プロットのS字フィットによって決定される、透明から混濁への移行の平均から混濁から透明への移行の平均として定義された。
【0137】
(実施例5)
配列番号1の領域His450-Asp462に挿入を有する組換えプロトロンビン。
材料及び方法
直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランを、Alsachim(France)から得た。血漿由来ヒトプロトロンビン、血漿由来ヒトトロンビン(アルファ-トロンビン、IIa)、血漿由来ヒトXa因子、血漿由来ヒトVa因子、及びトロンビン阻害剤ダンシルアルギニンN-(3-エチル-1,5-ペンタンジイル)アミド(DAPA)を、Haematologic Technologiesから得た。プロトロンビン枯渇ヒト血漿及びプロトロンビン時間凝固アッセイ試薬STA-Neoplastine CIプラス10を、Diagnostica Stagoから得た。ペプチジル基質S-2238を、Chromogenix(登録商標)(Instrumentation Laboratory)から得た。Rocheから入手されるインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム(ITS)を除いて、全ての組織培養試薬をLife Technologies(Thermo Fisher Scientific)から得た。一般的な組換えタンパク質の産生及び精製技術は、Green and Sambrook、Molecular Cloning、4th edition、July 2012に記載されているとおりであった。75%(w/w)の鶏卵L-ホスファチジルコリン及び25%(w/w)のブタ脳L-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids、Inc.、US)から構成される小型単層リン脂質ベシクル(PCPS)が調製され、以前に記載されているように特徴付けされた(Higgins et al.、J Biol Chem 258: 6503〜6508頁(1983))。
【0138】
野生型プロトロンビン(配列番号1)及び(i)配列番号5(シュードナジャテクスチリス(Pseudonaja textilis)アイソフォームX因子中の相同領域に由来する、プロトロンビンISO1)、(ii)配列番号13(プロトロンビンISO2)、(iii)配列番号14(タイガースネーク(Notechis scutatus)毒液X因子中の相同領域に由来する、プロトロンビンNSC)、(iv)配列番号15(ヒトカリクレイン10中の相同領域に由来する、プロトロンビンKL10)、又は(v)配列番号16(ヒトアルブミンに由来する、プロトロンビンALB)のアミノ酸配列をHis-450とAsp-462の間に有するプロトロンビン変異体をコードするプラスミド(pcDNA3.1(+))を、LipofectAMINE 2000(登録商標)(Invitrogen)を使用してHEK293細胞に導入した。高発現クローンを、本質的に記載(Orcutt et al.、J Biol Chem、279: 54927〜54936頁(2004))のように、プロトロンビン特異的なELISA及びプロトロンビン時間凝固アッセイに基づいて選択した。選択されたクローンを、175cm2フラスコへと増殖させ、5μg/ml ITS及び10μg/mlビタミンKを補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地中で培養した。馴化培地を、24時間収集し、30kDaスピンフィルターを使用して、HEPES緩衝生理食塩水(pH7.5)中に濃縮し、50% vol/volグリセロール中で-20℃で保存した。プロトロンビン抗原濃度を、プロトロンビン(CL20111K、Cedarlane Laboratories)の検出のため対の抗体ELISAを使用して決定した。プロトロンビン活性を、標準として既知濃度のプロトロンビンを用いて、プロトロンビン欠損血漿においてSTA-Neoplastin CIプラス10試薬を使用する、プロトロンビン特異的な一段階プロトロンビン時間凝固アッセイを用いて決定した。比活性(U/mg)は、プロトロンビン活性(U/ml)のプロトロンビン抗原濃度(mg/ml)に対する比から導かれた。
【0139】
直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランによるトロンビンの阻害
血漿由来プロトロンビン(Haematologic Technologies)又は組換え野生型プロトロンビン又は前の段落に記載された組換えプロトロンビン変異体(ISO1、ISO2、NSC、KL10、及びALB)(125nM)を、室温で5分間、10μM DAPAの存在下で、プロトロンビナーゼ(1nM Xa因子、50nM Va因子、50μM PCPS、5mMカルシウム)とインキュベーションすることによってトロンビンへと活性化した。サンプルを、EDTA(25mM最終)中で引き続いてクエンチし、EDTA(50mM)、NaCl(150mM)、0.1% PEG8000及びHEPES(20mM)、pH7.5を含有する緩衝液中で5nM(最終)に希釈した。活性化血漿由来プロトロンビン(pd-IIa)又は組換え活性化プロトロンビン(r-IIa)又は組換え活性化プロトロンビン変異体を結合及び阻害する直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランの能力を、固定濃度のS-2238(100μM)で、増加する濃度のダビガトラン(20nM〜20μM)を使用して、ペプチジル基質S-2238加水分解の初速度測定による最大半抑制濃度(IC50)を評価することによって試験した。ペプチジル基質に対する残留発色活性を、A405nmにセットされたマイクロプレートリーダー(SpectraMax M2e、Molecular Devices)において10分間で決定した。IC50濃度を、Graphpad Prism6ソフトウェアスイートを使用して、非線形回帰によるS-2238変換(mOD/min)のフィッティングによって得た。同じ実験を、血漿由来トロンビン(IIa、Haematologic Technologies)を対照として使用して行った。
【0140】
結果
これらの実験の結果を、Table 2(表2)並びに図6及び図7に示した。この全てから、プロトロンビンの請求されるアミノ酸残基領域における挿入が、凝固ポテンシャル又は凝固作用をなおも有しながら、直接的なトロンビン阻害剤、例えばダビガトランに対する感受性の減少もたらすことが分かる。
【0141】
【表2】
【0142】
Table 2(表2)は、異なるプロトロンビン変異体の特性を示す。血漿由来トロンビンはIIaとして示され、組換え野生型トロンビンはr-IIaとして示される。比活性(U/mg)は、プロトロンビン特異的な一段階プロトロンビン時間凝固アッセイを使用して決定される、プロトロンビン活性(U/ml)のプロトロンビン抗原濃度(mg/ml)に対する比から導かれる。発色活性のパーセンテージ(%)は、精製された血漿由来トロンビンの標準曲線と関連させた各プロトロンビン変異体のS-2238変換を表す。最大半抑制濃度(IC50)は、5nMトロンビン変異体の発色活性の50%阻害に必要とされるダビガトランの濃度を示す。
【0143】
(実施例6)
配列番号1のIle-542位でのアミノ酸残基の置換又は置き換えを有する組換えプロトロンビン。
材料及び方法
直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランを、Alsachim(France)から得た。血漿由来ヒトプロトロンビン、血漿由来ヒトトロンビン(アルファ-トロンビン、IIa)、血漿由来ヒトXa因子、血漿由来ヒトVa因子、及びトロンビン阻害剤ダンシルアルギニンN-(3-エチル-1,5-ペンタンジイル)アミド(DAPA)を、Haematologic Technologiesから得た。プロトロンビン枯渇ヒト血漿及びプロトロンビン時間凝固アッセイ試薬STA-Neoplastine CIプラス10を、Diagnostica Stagoから得た。ペプチジル基質S-2238を、Chromogenix(登録商標)(Instrumentation Laboratory)から得た。Rocheから入手されたインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム(ITS)を除いて、全ての組織培養試薬をLife Technologies(Thermo Fisher Scientific)から得た。一般的な組換えタンパク質の産生及び精製技術は、Green and Sambrook、Molecular Cloning、4th edition、July 2012に記載されているとおりであった。75%(w/w)の鶏卵L-ホスファチジルコリン及び25%(w/w)のブタ脳L-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids、Inc.、US)から構成される小型単層リン脂質ベシクル(PCPS)が調製され、以前に記載されているように特徴付けされた(Higgins et al.、J Biol Chem 258: 6503〜6508頁(1983))。
【0144】
野生型プロトロンビン(配列番号1)及び配列番号1のアミノ酸残基542位でのイソロイシンがアラニン(I542A、側鎖なし)、セリン(I542S、小さな側鎖)、フェニルアラニン(I542F、大きいかさばる側鎖)、又はグルタミン酸(I542E、荷電側鎖)で置換されたプロトロンビン変異体を、コードするプラスミド(pcDNA3.1(+))を、LipofectAMINE 2000(登録商標)(Invitrogen)を使用してHEK293細胞に導入した。高発現クローンを、本質的に記載(Orcutt et al.、J Biol Chem、279: 54927〜54936頁(2004))のように、プロトロンビン特異的なELISA及びプロトロンビン時間凝固アッセイに基づいて選択した。選択されたクローンを、175cm2フラスコへと増殖させ、5μg/ml ITS及び10μg/mlビタミンKを補充したダルベッコ改変イーグル培地/F-12培地中で培養した。馴化培地を、24時間収集し、30kDaスピンフィルターを使用して、HEPES緩衝生理食塩水(pH 7.5)中に濃縮し、50% vol/volグリセロール中で-20℃で保存した。プロトロンビン抗原濃度を、プロトロンビン(CL20111K、Cedarlane Laboratories)の検出のため対の抗体ELISAを使用して決定した。プロトロンビン活性を、標準として既知濃度のプロトロンビンを用いて、プロトロンビン欠損血漿においてSTA-Neoplastin CIプラス10試薬を使用する、プロトロンビン特異的な一段階プロトロンビン時間凝固アッセイを用いて決定した。比活性(U/mg)は、プロトロンビン活性(U/ml)のプロトロンビン抗原濃度(mg/ml)に対する比から導かれた。
【0145】
直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランによるトロンビンの阻害
組換え野生型プロトロンビン又は組換えプロトロンビン変異体(I542S、I542A、I542F及びI542E)(125nM)を、室温で5分間、10μM DAPAの存在下で、プロトロンビナーゼ(1nM Xa因子、50nM Va因子、50μM PCPS、5mMカルシウム)とインキュベーションすることによってトロンビンへと活性化した。サンプルを、EDTA(25mM最終)中で引き続いてクエンチし、EDTA(50mM)、NaCl(150mM)、0.1% PEG8000及びHEPES(20mM)、pH7.5を含有する緩衝液中で5nM最終に希釈した。組換え活性化プロトロンビン(r-IIa)又は組換え活性化プロトロンビン変異体を結合及び阻害する直接的なトロンビン阻害剤ダビガトランの能力を、固定濃度のS-2238(100μM)で、増加する濃度の直接的な阻害剤(20nM〜20μM)を使用して、ペプチジル基質S-2238加水分解の初速度測定による最大半抑制濃度(IC50)を評価することによって試験した。ペプチジル基質に対する残留発色活性を、A405nmにセットされたマイクロプレートリーダー(SpectraMax M2e、Molecular Devices)において10分間で決定した。IC50濃度を、Graphpad Prism6ソフトウェアスイートを使用して、非線形回帰によるS-2238変換(mOD/min)のフィッティングによって得た。同じ実験を、血漿由来トロンビン(IIa、Haematologic Technologies)を対照として使用して行った。
【0146】
結果
これらの実験の結果を、Table 3(表3)並びに図9及び図10に示した。この全てから、配列番号1のアミノ酸残基Ile-542位での置換、置き換え又は変異が、凝固ポテンシャル又は凝固作用をなおも有しながら、直接的なトロンビン阻害剤、例えばダビガトランに対する感受性の減少をもたらすことが分かる。
【0147】
【表3】
【0148】
Table 3(表3)は、プロトロンビン変異体の特性を示す。血漿由来トロンビンはIIaとして示され、組換え野生型トロンビンはr-IIaとして示される。比活性(U/mg)は、プロトロンビン特異的な一段階プロトロンビン時間凝固アッセイを使用して決定される、プロトロンビン活性(U/ml)のプロトロンビン抗原濃度(mg/ml)に対する比から導かれる。発色活性のパーセンテージ(%)は、精製された血漿由来トロンビンの標準曲線と関連させた各プロトロンビン変異体のS-2238変換を表す。最大半抑制濃度(IC50)は、5nMトロンビン変異体の発色活性の50%阻害に必要とされるダビガトランの濃度を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
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【国際調査報告】