(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】2019522959
(43)【公表日】20190822
(54)【発明の名称】等温核酸増幅のためのレポーター染料、クエンチャーが含まれる等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチド及びそれを用いた核酸増幅並びに測定方法
(51)【国際特許分類】
   C12Q 1/6876 20180101AFI20190726BHJP
   C12Q 1/6853 20180101ALI20190726BHJP
   C12P 19/34 20060101ALI20190726BHJP
   C12N 15/09 20060101ALN20190726BHJP
【FI】
   !C12Q1/6876 ZZNA
   !C12Q1/6853 Z
   !C12P19/34 A
   !C12N15/09 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
【全頁数】29
(21)【出願番号】2018528297
(86)(22)【出願日】20161130
(85)【翻訳文提出日】20180530
(86)【国際出願番号】KR2016013944
(87)【国際公開番号】WO2017095128
(87)【国際公開日】20170608
(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.TWEEN
2.Triton
(71)【出願人】
【識別番号】514305356
【氏名又は名称】エスディー バイオセンサー インコーポレイテッド
【住所又は居所】大韓民国 16690 キョンギド, スウォンシ, ヨントング, トギョンデロ, 1556ボンギル, 16, デジタル エンパイア シー−ドン, 4 アンド 5 フロアー
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】TRY国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ウェン ユトク
【住所又は居所】大韓民国 16963 ギョンギ−ド ヨンイン−シ キフン−グ クァンゴク−ロ 53、601ドン1202ホ(グガル−ドン ガヒョン マウル シンアン アパート)
(72)【発明者】
【氏名】パク へジュン
【住所又は居所】大韓民国 13611 ギョンギ−ド ソンナム−シ ブンダン−グ ネジョン−ロ 55、305ドン1007ホ(ジェンザ−ドン、サンロクマウル ウソン アパート)
(72)【発明者】
【氏名】ソン ヒョジン
【住所又は居所】大韓民国 16970 ギョンギ−ド ヨンイン−シ キフン−グ シング−ロ 22ボン−ギル 11−10、204ホ(グガル−ドン)
(72)【発明者】
【氏名】イム ミエ
【住所又は居所】大韓民国 17006 ギョンギ−ド ヨンイン−シ キフン−グ トンベク5−ロ 21−7
(72)【発明者】
【氏名】イ ソンヨン
【住所又は居所】大韓民国 17017 ギョンギ−ド ヨンイン−シ チェイン−グ サムガ−ロ 7 オレンジ ビル 406
【テーマコード(参考)】
4B063
4B064
【Fターム(参考)】
4B063QA01
4B063QA11
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QR32
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4B063QX02
4B064AF27
4B064CA12
4B064CC24
4B064DA13
(57)【要約】
本発明は、等温核酸増幅のためのレポーター染料、クエンチャーが含まれる等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチド及びそれを用いた核酸増幅並びに測定方法に関する。本発明は、LAMPの核酸増幅反応のために、4〜6種のオリゴヌクレオチド以外に追加的に設計されるオリゴヌクレオチドが不要であり、DNAとRNAに対するターゲット(target)遺伝子特異的配列の核酸増幅による蛍光量を検出し、反応終了後に検出も可能であり、リアルタイムでも蛍光量を検出することができる方法であって、ターゲット遺伝子に応じてレポーター染料を異ならせて一つのチューブで反応終了後又はリアルタイムで蛍光量を測定することによって、同時多重検査が可能であるという効果がある。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ターゲット遺伝子の特定の配列に対するループ媒介等温核酸増幅反応(LAMP)用プライマーのうち、フォワードインナープライマー(Forward Inner Primer)又はリバースインナープライマー(Reverse Inner Primer)を対象として、3’末端を除いた配列のうち一部の配列をインターナル(internal)dT、インターナル(internal)dG、インターナル(internal)dC、インターナル(internal)dA、インターナル(internal)dU、またはインターナル(internal)dRに配列を変形させ、この部位にレポーター染料又はクエンチャーを位置させ、一定温度以下で全体又は一部の配列が二本鎖を形成し、バブル構造が1個以上である、オリゴヌクレオチド。
【請求項2】
前記オリゴヌクレオチドは、レポーター染料とクエンチャーとの間隔が21〜33mer以内に位置する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することを特徴とする、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
前記オリゴヌクレオチドのレポーター染料は、FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY3、及びCY5のうちの1つであるか、または450〜685nmの発光波長帯の染料であることを特徴とする、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
前記オリゴヌクレオチドのクエンチャーは、TAMRA、DABCYL、Black Hole Quencher 1もしくは2であるか、または500〜705nmの吸光波長帯のクエンチャーであることを特徴とする、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
前記オリゴヌクレオチドは1〜4個のバブル構造を有する、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖から一本鎖に解離する融解温度が30〜70℃であることを特徴とする、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号5〜8、及び配列番号15〜16に記載されたオリゴヌクレオチドのうちの1つであることを特徴とする、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを使用して等温でリアルタイム核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応(LAMP)又は逆転写(RT)−LAMP反応を行う方法。
【請求項10】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを使用して等温又は2つ以上の温度条件で終点(end−point)核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応(LAMP)又は逆転写(RT)−LAMP反応を行う方法。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項12】
前記方法の等温温度条件は50〜75℃の範囲であることを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項13】
前記方法は、DNA及びcDNA核酸を対象として行うことを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項14】
前記方法は、RNA核酸を対象として逆転写反応後に特定の遺伝子をワンステップ反応で行うことを特徴とする、請求項9又は10に記載の方法。
【請求項15】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性または感受性検体に対する特定の遺伝子を個別又は同時多重的に増幅するキット。
【請求項16】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む等温核酸増幅反応用組成物。
【請求項17】
前記等温核酸増幅反応用組成物は、配列番号1〜18のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項16に記載の等温核酸増幅反応用組成物。
【請求項18】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むエボラウイルス(Ebola virus)核酸増幅用組成物。
【請求項19】
前記核酸増幅用組成物は、配列番号1〜18のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項18に記載のエボラウイルス(Ebola virus)核酸増幅用組成物。
【請求項20】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブを共に使用して、DNA、RNA、またはcDNAに対する等温核酸増幅反応を行う方法。
【請求項21】
前記アンチセンスプローブは、55〜65℃以内で設計及び使用することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項22】
前記オリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブは、フォワードとリバースの位置で個別又は共に使用することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項23】
前記アンチセンスプローブは、配列番号19〜23に記載された配列のうちの1つを有することを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、等温核酸増幅のためのレポーター染料、クエンチャーが含まれる等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチド及びそれを用いた核酸増幅並びに測定方法に関し、より詳細には、等温核酸増幅反応時にリアルタイム蛍光モニタリングを通じて反応時間毎に核酸増幅の有無の測定、及び終点(end−point)段階で蛍光量の測定を通じて反応産物の核酸増幅反応の有無を検出する等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチドの用途及びそれを用いた核酸増幅方法並びに測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸増幅技術は、分子生物学及び生命工学の分野で主に用いられる技術であって、少量の核酸を検出し、分析することができる方法である。核酸増幅のために耐熱性酵素(thermostable enzyme)を使用してDNA/RNAを分析するPCR(Polymerase chain reaction)技術が最も広く用いられる方法で、高い温度条件で二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させた後、温度を下げて一本鎖にプライマー(始発体)が結合し、Taqポリメラーゼ(thermostable enzyme)が二本鎖DNAに伸長させる過程が繰り返される方法である。
【0003】
蛍光物質を用いたリアルタイムPCR方法は、PCR過程中に蛍光の発光強度によって核酸を検出する方法であって、PCR反応物の中間位置に該当する相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに5‘末端にレポーター染料を付着させ、3’末端にクエンチャーが付着された一本鎖のプローブ(probe)を追加して、Taqポリメラーゼ(Taq polymerase)の5‘→3’エキソヌクレアーゼ(exonuclease)活性によって、PCR反応時に一本鎖のプローブが相補的な配列に結合し、Taqポリメラーゼの伸長反応によって、プローブが5‘末端から加水分解されてレポーター染料がクエンチャーから離れることによって蛍光を発し、リアルタイムPCR装備の蛍光探知器によって蛍光量を表示する。リアルタイムPCR装備の蛍光探知器によって蛍光波長を異ならせて2つ以上のターゲット(target)を検出する同時多重検出が可能であるため、病原体の検出及び突然変異の検出などの診断分野で多く使用される技術であって、高価のリアルタイムPCR装備及び熟練した技術者(technician)が必要であるという欠点を有している。
【0004】
高価のリアルタイムPCR装備なしに等温条件でDNA/RNAを検出し、PCR方法よりもさらに短時間内に核酸を検出する等温増幅法(Isothermal amplification method)が開発されている。RNA増幅のために、RNAポリメラーゼ(RNA polymerase)、逆転写酵素(reverse transcriptase)、Rnase Hのような酵素(enzyme)を使用するTMA(Transcription Mediated Amplification)、NASBA(Nucleic Acid Sequence−Based Amplification)方法があり、SDA(Strand Displacement Amplification)は、exonuclase−deficient DNA polymeraseが二本鎖の核酸を合成するために既存の鎖一つを置換(displacement)させ、制限酵素(restriction enzyme)でニック(nick)を形成させて、この過程が繰り返されながら核酸が増幅される方法であり、これと類似のNEAR(Nicking and Extension Amplification Reaction)は、制限酵素の代わりにニッキング酵素(nicking enzyme)を使用する方法である。HDA(Helicase−Dependent Amplification)は、5‘末端と3’末端から二本鎖をほどくヘリカーゼ(Helicase)の機能を用いたものであり、これと類似のRPA(Recombinase Polymerase Amplification)は、二本鎖をほどくリコンビナーゼ(recombinase)を用いた方法である。
【0005】
LAMP(Loop−mediated isothermal amplification)は、4〜6個の特異的プライマ(specific primer)と鎖置換活性(strand displacement activity)を有するDNAポリメラーゼ(DNA polymerase)を用いる核酸増幅技術(Patent.No.PCT/JP2000/001919)である。
【0006】
LAMPの測定方法では、アガロースゲル電気泳動分析を通じて、smeared patternのbandを確認して特定の遺伝子の核酸増幅反応の有無を分析することができるが、アガロースゲル電気泳動分析時に、反応チューブを開封して核酸汚染の根源となり得る。
【0007】
したがって、核酸汚染源の遮断のために、反応チューブを開封せずに測定できる技術が開発されており、一般的にLAMPで使用されている濁度測定法(Mori.Y.et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,289:150−154)は、等温核酸増幅反応物の増加に伴ってピロリン酸マグネシウム(Magnesium pyrophosphate、Mg)による白色沈殿物が蓄積されて400nMの波長の濁度を測定してリアルタイム検出及び終点(end−point)検出が可能であるので、反応チューブの開封なしに核酸増幅の有無を確認することができる。しかし、2つ以上のターゲット(target)区別のような同時多重検出は不可能であり、測定しようとするピロリン酸マグネシウムの沈殿により、測定法に対する正確度が低いという欠点がある。
【0008】
LAMPで核酸増幅の有無をリアルタイムで測定するための蛍光検出法は、反応チューブの開封なしに蛍光物質のみを測定することで、汚染の発生を除去し、沈殿物の発生による正確度減少の問題もなくし得るという利点を有している。
【0009】
LAMPでSYBR Green Iのような二本鎖特異インターカレーター(Intercalater)を反応液に添加して、核酸増幅反応物の増加に伴って蛍光強度が増大してリアルタイム測定が可能である。リアルタイムPCR増幅反応においても使用されるSYBR Green Iは、核酸増幅産物の配列特異的に確認されないため、プライマーダイマー(primer dimer)の発生にも蛍光度が測定されてしまい、非特異反応の区別のためには、リアルタイム測定以降に温度を95℃まで徐々に高めて核酸増幅反応物の融解温度を測定して非特異反応の有無を判断しなければ、検出の有無を確認することができず、2つ以上のターゲット(target)区別のような同時多重検出は不可能である。
【0010】
LAMPによる核酸増幅配列特異的に蛍光を検出するための技術が開発された。同化プローブ(Assimilating probe)は、核酸増幅配列特異的に設計された二本のプローブであって、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)原理を用いてリアルタイムで測定する方法(Patent.No.PCR/US11/41540)である。二本のプローブのうち、一方はレポーター染料が5‘末端に付着され、他方は3’末端にクエンチャーが位置する。LAMP核酸増幅に使用されるオリゴヌクレオチドの数は6種で、多数のプライマー(primer)が含まれ、同化プローブは、これらのうちループプライマー(loop primer)の一つを対象として、5‘末端にレポーター染料を付着させた一方のプローブを設計し、これに相補的な配列を一部を設計して、3’末端にクエンチャーを付着させた他方のプローブを設計して7種のオリゴヌクレオチドを合成しなければならず、同化プローブは、LAMP反応の前に2つのプローブを高温から低温に徐々に温度を減少させて一対のプローブに合成して核酸増幅に使用される。LAMPにおいて遺伝子配列特異的なリアルタイム検出のために同化プローブを使用することで、核酸増幅反応時にLAMP反応の抑制効果が示され、検出時間とリアルタイム測定時間が長くなる。
【0011】
同化プローブと類似のプローブを使用する蛍光検出法として、蛍光プローブ(fluorephore−labeled primer/probe)とクエンチャープローブ(quencher−labeled probe)を相補的な配列を有するように設計して一対のプローブを使用する方法(Patent No.PCT/JP2012/077596)がある。蛍光プローブとクエンチャープローブの融解温度を異ならせて設計して、LAMP核酸増幅反応中には蛍光プローブのみがターゲット遺伝子特異配列にアニーリングして反応し、LAMP核酸増幅反応の終了後に温度を下げて、残存している蛍光プローブがクエンチャープローブと結合した後、蛍光量を検出する方法である。この一対のプローブはリアルタイム検出を確認することができず、同化プローブと同様に、一つのオリゴヌクレオチドが追加されて設計されなければならない。
【0012】
LAMP核酸増幅反応においてリアルタイム検出及び蛍光量の測定を通じて、反応チューブの開封なしに核酸増幅の有無を確認することで、汚染による偽陽性反応を解決し、低濃度で存在するターゲット(target)核酸の増幅の有無を敏感に測定するための技術が開発されたが、濁度の測定及びインターカレーター蛍光測定のようなターゲット核酸配列に特異的ではない方法は、非特異増幅の有無を確認することができず、同時多重核酸検出が不可能であるという制限点があり、プローブを使用する方法は、ターゲット遺伝子配列特異的に設計が可能であり、様々なレポーター染料とクエンチャーを使用するので、同時多重核酸検出の実行が可能である。しかし、LAMPに使用される6種のオリゴヌクレオチド以外に、一対のプローブを形成させるためのクエンチャープローブというオリゴヌクレオチドの設計が必要であり、一対のプローブを反応物の調製の前に合成させて反応物に添加させなければならない過程が追加される。また、一対のプローブの設計位置は、ループプライマーを代替して蛍光プローブとして設計しなければならない。ループプライマーは、LAMP反応時に、ダンベル構造のループ(loop)が形成された後にアニーリングして、次の過程が進行するため、蛍光が測定される時点は、実際に核酸が増幅される時点よりも蛍光検出時間が遅延して測定される。同化プローブはLAMPの反応性に抑制効果を与え、蛍光プローブとクエンチャープローブを使用する方法の場合は、リアルタイム検出を行うことができず、反応終了後に温度が低くならなければ検出できないという制限点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、上記問題点を解決し、上記の必要性によって案出されたもので、本発明の目的は、LAMPの核酸増幅反応のために4〜6種のオリゴヌクレオチド以外に追加的に設計されるオリゴヌクレオチドがなく、ターゲット(target)遺伝子配列特異的に検出が可能であり、反応終了後の検出ではなく、リアルタイムで検出できる技術の開発、及びLAMP等温増幅過程中に現れる増幅産物をリアルタイムで測定し、同時多重検査が可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
上記目的を達成するために、本発明は、ターゲット遺伝子の特定の配列に対するループ媒介等温核酸増幅反応(LAMP)用プライマーのうち、フォワードインナープライマー(Forward Inner Primer)又はリバースインナープライマー(Reverse Inner Primer)を対象として、3’末端を除いた配列のうち一部の配列をインターナル(internal)dT、インターナル(internal)dG、インターナル(internal)dC、インターナル(internal)dA、インターナル(internal)dU、またはインターナル(internal)dRに配列を変形させ、この部位にレポーター染料又はクエンチャーを位置させ、一定温度以下で全体又は一部の配列が二本鎖を形成し、バブル構造が1個以上であるオリゴヌクレオチドを提供する。
【0015】
本発明の一具現例において、前記オリゴヌクレオチドは、レポーター染料とクエンチャーとの間隔が21〜33mer以内に位置することが好ましいが、これに限定されない。
【0016】
本発明の他の具現例において、前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することが好ましいが、これに限定されない。
【0017】
本発明の一実施例において、前記オリゴヌクレオチドのレポーター染料は、FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY3、及びCY5のうちの1つであるか、または450〜685nmの発光波長帯であるものが好ましく、
前記オリゴヌクレオチドのクエンチャーは、TAMRA、DABCYL、Black Hole Quencher 1もしくは2であるか、または500〜705nmの吸光波長帯であるものが好ましいが、これに限定されない。
【0018】
本発明の一具現例において、前記オリゴヌクレオチドは1〜4個のバブル構造を有することが好ましく、
前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖から一本鎖に解離する融解温度が30〜70℃であることが好ましいが、これに限定されない。
【0019】
本発明の一実施例において、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号5〜8、及び配列番号15〜16に記載されたオリゴヌクレオチドのうちの1つであることが好ましいが、これに限定されない。
【0020】
また、本発明は、本発明の前記オリゴヌクレオチドを使用して等温でリアルタイム核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応(LAMP)又は逆転写(RT)−LAMP反応を行う方法を提供する。
【0021】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを使用して等温又は2つ以上の温度条件で終点(end−point)核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応(LAMP)又は逆転写(RT)−LAMP反応を行う方法を提供する。
【0022】
本発明の方法において、前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することが好ましく、
前記方法の等温温度条件は50〜75℃の範囲であることが好ましいが、これに限定されない。
【0023】
本発明の方法において、前記方法は、DNA及びcDNA核酸を対象として行うことが好ましく、前記方法は、RNA核酸を対象として逆転写反応後に特定の遺伝子をワンステップ反応で行うことが好ましいが、これに限定されない。
【0024】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性または感受性検体に対する特定の遺伝子を個別又は同時多重的に増幅するキットを提供する。
【0025】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むエボラウイルス(Ebola virus)核酸増幅用組成物を提供する。
【0026】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む等温核酸増幅反応用組成物を提供する。
【0027】
本発明の一具現例において、前記組成物は配列番号1〜18のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましいが、これに限定されない。
【0028】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブを共に使用して、DNA、RNA、またはcDNAに対する等温核酸増幅反応を行う方法を提供する。
【0029】
本発明の一具現例において、前記アンチセンスプローブは、55〜65℃以内で設計及び使用することが好ましいが、これに限定されない。
【0030】
本発明の他の具現例において、前記オリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブは、フォワードとリバースの位置で個別又は共に使用することが好ましいが、これに限定されない。
【0031】
本発明の更に他の具現例において、前記アンチセンスプローブは、配列番号19〜23に記載された配列のうちの1つを有することが好ましいが、これに限定されない。
【0032】
以下、本発明を説明する。
【0033】
本発明で使用された略語は、次の通りである:
【0034】
Internal dT : Internal Amino-C6(or C2)- deoxythymine
【0035】
Internal dA : Internal Amino-C6- deoxyadenocine
【0036】
Internal dC : Internal Amino-C6- deoxycytidine
【0037】
Internal dG : Internal Amino-C6- deoxyguanosine
【0038】
Internal dU : Internal Amino-C6- deoxyuridine
【0039】
Internal dR : Internal Amino-C6- deoxyribose
【0040】
本発明は、Loop−mediated isothermal amplification(LAMP)方法のFIP(Forward Inner Primer)とRIP(Reverse Inner Primer)は、それぞれ2つのターゲット(target)遺伝子部位に対するプライマー(primer)が一つのオリゴヌクレオチドとして設計されており、この2つのターゲット遺伝子部位の間に1つ以上のバブル構造を形成させ、3‘末端を除いて5’末端又はチミン(Thymine)部位をinternal dTに変形させ、レポーター染料又はクエンチャーを付着させる構造で、一つのIB−DFOには一つのレポーター染料と一つのクエンチャーが位置してプライマー及びプローブの2つの機能を行い、等温核酸増幅反応時にリアルタイム蛍光モニタリングを通じて反応時間毎に核酸増幅の有無の測定、及び終点(end−point)段階で蛍光モニタリングを通じて反応産物の蛍光測定により等温核酸増幅反応の有無を検出する等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチドの用途及びそれを用いた核酸増幅方法並びに測定方法を提供する。
【0041】
本発明は、ターゲット遺伝子の特定の配列に対するLAMP等温核酸増幅反応用プライマーのうち、FIP又はRIPを対象として、3’末端を除いた配列にチミン(Thymine)塩基をinternal dTに、またはアデニン(Adenine)、チミン(Thymine)、グアニン(Guanine)、シトシン(Cytosine)、ウリジン(Uridine)塩基をinternal dRに変形させ、この部位にレポーター染料又はクエンチャーを位置させ、一定温度以下で全体又は一部の配列が二本鎖を形成し、バブル構造が1個以上であるオリゴヌクレオチドを提供する。
【0042】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ターゲットDNA及びcDNA、RNAの特定の遺伝子配列の等温核酸増幅のために、等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチドを1つ以上含む等温核酸増幅反応混合物を提供する。
【0043】
本発明は、前記反応混合物の組成をTris−HCl、KCl、(NHSO、MgCl、MgSO、ベタイン(Betaine)、DTT(Dithiothreitol)、Triton X−100、Tween−20、dNTPs、ウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin;BSA)、DMSO(Dimethyl sulfoxide)、ホルムアミド(Formamide)、一本鎖結合タンパク質(Single strand binding protein)、ピロホスフェート(Pyrophosphate)、ピロホスファターゼ(Pyrophosphatase)などを含み、5‘→3’エキソヌクレアーゼ(exonuclease)(−)、3’→5’エキソヌクレアーゼ(−)、鎖置換(strand displacement)活性を有しているDNAポリメラーゼと共にIB−DFOを含むLAMP核酸増幅反応用混合物である。そして、RNase inhibitorとAvian Myeloblastosis Virus(AMV) Reverse transcriptase、Molony Murine Leukemia Virus(MMLV) Reverse transcriptaseなどの逆転写酵素(Reverse transcriptase)と熱安定性逆転写酵素(thermostable Reverse transcriptase)、逆転写酵素の機能を有しているDNAポリメラーゼと共にIB−DFOを含むRT−LAMP核酸増幅反応用混合物を使用するものである。
【0044】
本発明のオリゴヌクレオチドは、レポーター染料とクエンチャーとの間隔が21〜33mer以内に位置するオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【0045】
本発明のオリゴヌクレオチドのフォワードプローブ(forward probe)であるFIP−IB−DFOとリバースプローブ(reverse probe)であるRIP−IB−DFOを個別又は共に使用することを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。
【0046】
本発明のオリゴヌクレオチドのレポーター染料はFAM、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY3、及びCY5のうちの1つを含み、450〜685nmの発光波長帯を含むオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【0047】
本発明のオリゴヌクレオチドのクエンチャーをTAMRA、DABCYL、Black Hole Quencher 1,2を含み、500〜705nmの吸光波長帯を含むオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【0048】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して等温でリアルタイム核酸増幅蛍光検出のためのLAMP及びRT−LAMP反応方法を提供する。
【0049】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して等温又は2つ以上の温度で終点(end−point)核酸増幅蛍光検出のためのLAMP及びRT−LAMP反応方法を提供する。
【0050】
前記方法は、オリゴヌクレオチドIB−DFOとして0.2〜1.6uMの濃度のFIP又はRIP、あるいはFIP及びRIPを含む混合物を提供し、これに限定するものではない。
【0051】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用したLAMP反応方法の等温温度条件が50〜75℃の範囲を有する方法を提供し、これに限定するものではない。
【0052】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用してDNA及びcDNA核酸を対象として行う方法を提供する。
【0053】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用してRNA核酸を対象として逆転写反応後に特定の遺伝子をワンステップ反応で行う方法を提供する。
【0054】
本発明のオリゴヌクレオチドは、1〜4個のバブル構造を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【0055】
本発明のオリゴヌクレオチドは、二本鎖から一本鎖に解離する融解温度が30〜70℃であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【0056】
本発明のオリゴヌクレオチドを含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性または感受性検体のDNA及びcDNA、RNAに対する特定の遺伝子を個別又は同時多重に増幅するキットを提供する。
【0057】
本発明のオリゴヌクレオチドは、エボラウイルス(Ebola virus)のサブタイプ(subtype)であるBundibugyoとRestonに対する配列番号1〜18までオリゴヌクレオチド配列とLAMP及びRT−LAMP primer配列を提供する。
【発明の効果】
【0058】
本発明から分かるように、本発明は、LAMPの核酸増幅反応のために、4〜6種のオリゴヌクレオチド以外に追加的に設計されるオリゴヌクレオチドが不要であり、DNAとRNAに対するターゲット(target)遺伝子特異的配列の核酸増幅による蛍光量を検出し、反応終了後に検出も可能であり、リアルタイムでも蛍光量を検出することができる方法であって、ターゲット遺伝子に応じてレポーター染料を異ならせて一つのチューブで反応終了後又はリアルタイムで蛍光量を測定することによって、同時多重検査が可能であるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)のレポーター染料とクエンチャーとの間のmer数(距離)の33mer、25mer、21merによるLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定の結果である。
【図2】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)のフォワードインナープライマー(forward inner primer;FIP)とリバースインナープライマー(reverse inner primer;RIP)として設計されたIB−DFOを個別的に使用してLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図3】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)のフォワードインナープライマー(FIP)とリバースインナープライマー(RIP)として設計されたIB−DFOを個別又は共に適用してLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図4】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)をFIPとFIPの配列で設計されたIB−DFOでFIP:FIP−IB−DFOの比率を0:1.6uM/0.4:1.2uM/0.8:0.8uM/1.2:0.4uM/1.4:0.2uM/1.6:0uMにしてLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図5】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)をFIPとFIPの配列で設計されたIB−DFOでFIP:FIP−IB−DFOの比率を0:1.6uM/0.4:1.2uM/0.8:0.8uM/1.2:0.4uM/1.4:0.2uM/1.6:0uMにしてLAMP核酸増幅反応に対する終点(end−point)蛍光測定を行った結果である。
【図6】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)を使用してプラスミドDNA(plasmid DNA)を鋳型としてLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図7】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)を使用してプラスミドDNAを鋳型としてLAMP核酸増幅反応に対する終点(end−point)蛍光測定を行った結果である。
【図8】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)を使用してRNA転写物(RNA transcript)を鋳型としてワンステップRT−LAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図9】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)を使用してRNA転写物を鋳型としてワンステップRT−LAMP核酸増幅反応に対する終点(end−point)蛍光測定を行った結果である。
【図10-13】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)及び温度別(55℃、60℃、65℃、70℃)に設計されたクエンチャーが含まれたアンチセンスプローブ(anti−sense probe)を使用してプラスミドDNAを鋳型としてLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図14】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)及び温度別(55℃、60℃、65℃、70℃)に設計されたクエンチャーが含まれたアンチセンスプローブ(anti−sense probe)を使用してプラスミドDNAを鋳型としてLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定の結果のRn vs min(non−normalization)typeの結果である。
【図15-17】本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)をフォワード(forward)、またはリバース(reverse)、またはフォワード(F)及びリバース(R)を使用し、これに相補的な配列を60℃に設計したクエンチャーが含まれたアンチセンスプローブ(anti−sense probe)を共にプラスミドDNAを鋳型としてLAMP核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【0060】
以下、実施例を通じて本発明を詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【0061】
実施例1:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)のレポーター染料とクエンチャーとの距離(mer数)による蛍光検出効果の分析
【0062】
本発明のIB−DFOのレポーター染料とクエンチャーとの距離(mer数)によるLAMP等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるBundibugyoのL segment(Polymerase)部位の配列に対してLAMP等温核酸増幅用の4種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。
【0063】
設計されたプライマーは、EB_B_F3(配列番号1)、EB_B_R3(配列番号2)、EB_B_FIP(配列番号3)、EB_B_RIP(配列番号4)であり、IB−DFOは、EB_B_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、33mer(EB_B_FIP_P2、配列番号5)、25mer(EB_B_FIP_P2.5、配列番号6)、21mer(EB_B_FIP_P3、配列番号7)間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着した。3つのIB−DFOが二本鎖から一本鎖に解離する温度(Melting temperature)は54℃と示された。
【0064】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、50mM KCl、10mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、1.4mM dNTP each、0.5M Betaine、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_B_F3とEB_B_R3を0.2uM使用し、EB_B_FIPは1.2uM、EB_B_RIPは1.6uMを混合物に添加し、IB−DFOは0.4uMを追加した。エボラウイルスのBundibugyo L segment(gb:FJ217161、521bp)を遺伝子合成を通じて作製して、1×10^7、1×10^5、1×10^3、0 copies/reaction濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で60分間行い、1分単位でCFX−96(Bio−Rad、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【0065】
図1は、IB−DFOのレポーター染料とクエンチャーとの間隔に対するLAMP等温核酸増幅反応の結果であり、33mer、25mer、21merの間隔で設計されたIB−DFOを使用して、1×10^7 copies/reactionでそれぞれ11.98分、12.03分、12.16分と示され、1×10^5 copies/reactionは、それぞれ15.3分、15.28分、15.73分、1×10^3 copies/reactionは、それぞれ20.42分、20.09分、22.29分として類似蛍光検出時間が観察され、0 copies/reactionでD.W.のみを添加した反応では蛍光シグナルが検出されなかった。したがって、IB−DFOのレポーター染料とクエンチャーは、21〜33mer以内で蛍光量が測定された。この中で25mer IB−DFOで最も高いRFU(Relative fluorescence unit)が確認された。
【0066】
実施例2:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)のフォワード、リバース位置での使用効果の分析
【0067】
本発明のIB−DFOをフォワード又はリバース位置で使用時に、LAMP等温核酸増幅反応による蛍光検出の効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるBundibugyoのL segment(Polymerase)部位の配列に対してLAMP等温核酸増幅用の4種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。設計されたプライマーは、EB_B_F3(配列番号1)、EB_B_R3(配列番号2)、EB_B_FIP(配列番号3)、EB_B_RIP(配列番号4)であり、IB−DFOとしては、EB_B_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、33mer間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着したEB_B_FIP_P2(配列番号5)、及びEB_B_RIP primer配列にFAMレポーター染料とBHQ1クエンチャーを30merの間隔で設計したEB_B_RIP_P2(配列番号8)を使用した。
【0068】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、50mM KCl、10mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、1.4mM dNTP each、0.5M Betaine、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_B_F3とEB_B_R3を0.2uM使用し、EB_B_FIPは1.2又は1.6uM、EB_B_RIPは1.2又は1.6uMを混合物に添加し、EB_B_FIP_P2及びEB_B_RIP_P2は個別に0.4uMずつ追加した。エボラウイルスのBundibugyo L segment(gb:FJ217161,521bp)を遺伝子合成を通じて作製して、1×10^7、1×10^5、1×10^3、0 copies/reaction濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で60分間行い、1分単位でCFX−96(Bio−Rad、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【0069】
図2は、FIP及びRIPとして設計されたIB−DFOを個別に使用してLAMP等温核酸増幅反応を行った結果であって、EB_B_FIP_P2を含むか、またはEB_B_RIP_P2を含む反応において1×10^7 copies/reactionでそれぞれ12.3分、13.02分と示され、1×10^5 copies/reactionは、それぞれ15.92分、16.13分、1×10^3 copies/reactionは、それぞれ18.94分、18.59分として類似蛍光検出時間が観察され、0 copies/reactionでD.W.のみを添加した反応では蛍光シグナルが検出されなかった。したがって、IB−DFOの設計時にFIP及びRIPの位置と関係なく、類似のLAMP等温核酸増幅に対するリアルタイム蛍光検出を確認した。
【0070】
実施例3:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)をフォワード、リバース位置で個別又は共に使用時に蛍光検出効果の分析
【0071】
本発明のIB−DFOをフォワード又はリバース位置で共に使用時にLAMP等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるRestonのL segment(Polymerase)部位の配列に対してLAMP等温核酸増幅用の6種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。設計されたプライマーは、EB_R_F3(配列番号9)、EB_R_R3(配列番号10)、EB_R_FIP(配列番号11)、EB_R_RIP(配列番号12)、Res_LP(配列番号13)、Res_RLP(配列番号14)であり、IB−DFOとしては、EB_R_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、31mer間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着したEB_R_FIP_P2(配列番号15)、及びEB_R_RIP primerの配列にFAMレポーター染料とクエンチャーを33merの間隔で設計したEB_R_RIP_P2(配列番号16)を使用した。
【0072】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、50mM KCl、10mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、1.4mM dNTP each、0.5M Betaine、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_R_F3とEB_R_R3を0.2uM、Res_LPとRes_RLPは0.8uMを使用し、EB_R_FIPは1.2又は1.6uM、EB_R_RIPは1.2又は1.6uMを混合物に添加し、EB_R_FIP_P2とEB_R_RIP_P2は、個別に0.4uMずつ追加した。EB_R_FIP_P2とEB_R_RIP_P2を共に使用する条件では、それぞれ0.2uMを添加し、EB_R_FIPとEB_R_RIP primerはそれぞれ1.4uMを使用した。エボラウイルスのReston L segment(gb:JX477166、410bp)を遺伝子合成を通じて作製して、1×10^4、1×10^3、0 copies/reaction濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で30分間行い、1分単位でCFX−96(Bio−Rad、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【0073】
図3は、FIP及びRIPとして設計されたIB−DFOを個別又は共に使用してLAMP等温核酸増幅反応を行った結果であって、EB_R_FIP_P2を含む反応、EB_B_RIP_P2を含む反応、及びEB_R_FIP_P2とEB_B_RIP_P2を共に使用する反応において1×10^4 copies/reactionでそれぞれ16.02分、16.95分、16.40分と示され、1×10^3 copies/reactionは、それぞれ18.41分、18.65分、20.64分として類似蛍光検出時間が観察され、0 copies/reactionでD.W.のみを添加した反応では蛍光シグナルが検出されなかった。したがって、FIPとRIPに対するIB−DFOは個別又は共に使用しても、類似のLAMP等温核酸増幅に対するリアルタイム蛍光検出を確認した。
【0074】
実施例4:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)と同一の配列で設計されたインナープライマー(inner primer)の比率による蛍光検出効果の分析
【0075】
本発明のIB−DFOとインナープライマーは同一の配列で設計されており、これら2つの比率による、LAMP等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるBundibugyoのL segment(Polymerase)部位の配列に対してLAMP等温核酸増幅用の4種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。設計されたプライマーは、EB_B_F3(配列番号1)、EB_B_R3(配列番号2)、EB_B_FIP(配列番号3)、EB_B_RIP(配列番号4)であり、IB−DFOとしては、EB_B_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、33mer間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着したEB_B_FIP_P2(配列番号5)を使用した。
【0076】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、50mM KCl、10mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、1.4mM dNTP each、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_B_F3とEB_B_R3を0.2uM使用し、EB_B_RIPは1.6uMを使用し、EB_B_FIP:EB_B_FIP_P2は、0:1.6uM、0.4:1.2uM、0.8:0.8uM、1.2:0.4uM、1.6:0uMの比率でそれぞれ混合物に添加した。エボラウイルスのBundibugyo L segment(gb:FJ217161、521bp)を遺伝子合成を通じて作製して、1×10^7 copies/reaction濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で60分間行い、1分単位でCFX−96(Bio−Rad、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。そして、終点(end−point)蛍光検出のために、65℃で60分間行った後、30℃で1分ずつ10cycles反応して蛍光量を測定した。
【0077】
図4及び図5の結果から、inner primer:IB−DFOの比率が0:1.6uMで、inner primerを使用しなくても、inner primerが添加された条件と類似の蛍光検出時間を確認し、IB−DFOの濃度が減少するにつれてRFUが減少する結果が観察された。
【0078】
図4は、リアルタイム蛍光検出の結果であり、図5は、終点(end−point)蛍光検出の結果であって、IB−DFOの濃度が減少するにつれてRFUが減少するという同一の様相を確認した。したがって、IB−DFOは、プライマー及びプローブの2つの機能を共に行うものと確認され、リアルタイム蛍光検出及び終点(end−point)蛍光検出を行うことができるという利点を有している。
【0079】
実施例5:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)を適用してプラスミドDNA(plasmid DNA)を鋳型としたLAMP等温核酸増幅蛍光検出効果の分析
【0080】
本発明のIB−DFOをFIPの位置に添加使用してプラスミドDNAを鋳型としてLAMP等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるBundibugyoのL segment(Polymerase)部位の配列に対してLAMP等温核酸増幅用の6種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。設計されたプライマーは、EB_B_F3(配列番号1)、EB_B_R3(配列番号2)、EB_B_FIP(配列番号3)、EB_B_RIP(配列番号4)、EB_BLP_F(配列番号17)、EB_B_LP_R(配列番号18)であり、IB−DFOとしては、EB_B_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、33mer間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着したEB_B_FIP_P2(配列番号5)を使用した。
【0081】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、50mM KCl、10mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、1.4mM dNTP each、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_B_F3とEB_B_R3を0.2uM、EB_B_LP_FとEB_B_LP_Rは0.8uMを使用し、EB_B_FIPは1.2uM、EB_R_RIPは1.6uMを混合物に添加し、本発明のIB−DFOであるEB_B_FIP_P2は0.4uMを混合物に追加した。エボラウイルスのBundibugyo L segment(gb:FJ217161、521bp)を遺伝子合成を通じて作製して、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4、1×10^3、1×10^2、1×10^1、0 copies/reaction濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で60分間行い、1分単位でCFX−96(Bio−Rad、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。そして、終点(end−point)蛍光検出のために、65℃で60分間行った後、30℃で1分ずつ10cycles反応して蛍光量を測定した。
【0082】
図6は、IB−DFOを使用してプラスミドDNAに対する低濃度区間の敏感度をリアルタイム蛍光測定を行った結果であって、1×10^7〜1×10^2 copies/reactionまで陽性検出を確認し、1×10^1及び0 copies/reactionは陰性検出と確認された。検出時間は、高濃度からそれぞれ6.29分、8.01分、9.12分、10.12分、11.73分、13.17分として蛍光検出時間が観察された。
【0083】
図7は、終点(end−point)蛍光検出の測定結果であって、リアルタイム蛍光測定の結果と同一に、1×10^7〜1×10^2 copies/reactionまで陽性検出を確認し、1×10^1及び0 copies/reactionは陰性検出と確認された。
【0084】
図6及び図7の結果から、本発明のIB−DFOを使用時に、リアルタイム及び終点(end−point)蛍光検出が鋳型の濃度によって同一に検出の有無を確認することができ、リアルタイム蛍光検出方法を使用する場合、LAMP核酸増幅反応時間を短縮させることができる。
【0085】
実施例6:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)を適用してRNA転写物(RNA transcript)を鋳型としたRT−LAMP等温核酸増幅蛍光検出効果の分析
【0086】
本発明のIB−DFOをFIPの位置に添加使用してRNA転写物を鋳型としてRT−LAMP等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるBundibugyoのL segment(Polymerase)部位の配列に対してRT−LAMP等温核酸増幅用の6種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。設計されたプライマーは、EB_B_F3(配列番号1)、EB_B_R3(配列番号2)、EB_B_FIP(配列番号3)、EB_B_RIP(配列番号4)、EB_BLP_F(配列番号17)、EB_B_LP_R(配列番号18)であり、IB−DFOとしては、EB_B_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、25mer間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着したEB_B_FIP_P2.5(配列番号6)を使用した。
【0087】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、50mM KCl、10mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、5mM DTT、5U RNase inhibitor(New England Biolabs、MA、USA)、1.4mM dNTP each、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_B_F3とEB_B_R3を0.2uM、EB_B_LP_FとEB_B_LP_Rは0.8uMを使用し、EB_B_FIPは1.4uM、EB_R_RIPは1.6uMを混合物に添加し、本発明のIB−DFOであるEB_B_FIP_P2.5は0.2uMを混合物に追加した。エボラウイルスのBundibugyo L segment(gb:FJ217161,521bp)を遺伝子合成を通じてプラスミドDNA(plasmid DNA)を作製し、本プラスミドDNAをMEGAscript T7 Transcription Kit(Applied Biosystems、CA、USA)を使用してin vitro transcriptionを通じてRNA transcriptを合成した。Bundibugyo RNA transcriptを1×10^5、1×10^4、1×10^3、0 copies/reaction濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で30分間行い、1分単位でCFX−96(Bio−Rad、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。そして、終点(end−point)蛍光検出のために、65℃で60分間行った後、30℃で1分ずつ10cycles反応して蛍光量を測定した。
【0088】
図8は、IB−DFOを使用してRNA転写物(RNA transcript)に対するRT−LAMP等温核酸増幅リアルタイム蛍光測定を行った結果であって、1×10^5〜1×10^3 copies/reactionまで陽性検出を確認し、D.Wを使用した0 copies/reactionは陰性検出と確認された。検出時間は、高濃度からそれぞれ8.72分、10.03分、10.98分として蛍光検出時間が観察された。
【0089】
図9は、終点(end−point)蛍光検出の測定結果であって、リアルタイム蛍光測定の結果と同一に1×10^5〜1×10^3 copies/reactionまで陽性検出を確認し、D.Wを使用した0 copies/reactionは陰性検出と確認された。
【0090】
図8及び図9の結果から、本発明のIB−DFOを使用してワンステップRT−LAMP反応時に、リアルタイム及び終点(end−point)蛍光検出が鋳型の濃度によって同一に検出の有無を確認することができ、リアルタイム蛍光検出方法を使用する場合、ワンステップRT−LAMP核酸増幅反応においても、DNAを使用するLAMPと同様に反応時間を短縮することができる。
【0091】
実施例7:本発明のオリゴヌクレオチド(IB−DFO)及び温度別(55℃、60℃、65℃、70℃)に設計されたクエンチャーを含むアンチセンスプローブ(anti−sense probe)を適用してプラスミドDNA(plasmid DNA)を鋳型としたLAMP等温核酸増幅蛍光検出効果の分析
【0092】
本発明のIB−DFOをFIPの位置に添加し、IB−DFOのレポーター染料の配列から3‘末端まで相補的なアンチセンス(anti−sense)配列を温度別(55℃、60℃、65℃、70℃)に設計して、アンチセンス配列の3’末端にクエンチャーを位置させてアンチセンスプローブを設計した。そして、IB−DFOをRIPの位置に添加し、アンチセンスプローブを60℃に設計した。これを使用して、プラスミドDNAを鋳型としてLAMP等温核酸増幅反応においてアンチセンスプローブの温度別の設計によるリアルタイム蛍光検出の効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの1つであるBundibugyoのL segment(Polymerase)部位の配列に対してLAMP等温核酸増幅用の6種のプライマーをPrimerExplorer V4 Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)で設計した。設計されたプライマーは、EB_B_F3(配列番号1)、EB_B_R3(配列番号2)、EB_B_FIP(配列番号3)、EB_B_RIP(配列番号4)、EB_BLP_F(配列番号17)、EB_B_LP_R(配列番号18)であり、IB−DFOとしては、EB_B_FIP primer配列にチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位をFAMレポーター染料に変形させ、25mer間隔の位置のチミン(Thymine)をinternal dTに変形し、この部位にBHQ1クエンチャーを付着したEB_B_FIP_P2(配列番号5)を使用した。アンチセンスプローブは、55℃に設計されたEB_B_FIP_P2_Q2_55(配列番号19)、60℃に設計されたEB_B_FIP_P2_Q2_60(配列番号20)、65℃に設計されたEB_B_FIP_P2_Q2_65(配列番号21)、70℃に設計されたEB_B_FIP_P2_Q2_70(配列番号22)を使用した。そして、EB_B_RIP_P2(配列番号8)のIB−DFOに相補的なアンチセンスプローブを60℃に設計したEB_B_RIP_P2_Q60(配列番号23)を使用した。
【0093】
前記IB−DFOオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、20mM Tris−HCl(pH8.8)、10mM KCl、8mM MgSO、10mM (NHSO、0.1% Tween−20、1.4mM dNTP each、8U Bst DNA polymerase(MCLAB、CA、USA)、EB_B_F3とEB_B_R3を0.2uM、EB_B_LP_FとEB_B_LP_Rは0.4uMを使用し、EB_B_FIPは1.2uM、EB_R_RIPは1.6uMを混合物に添加し、本発明のIB−DFOであるEB_B_FIP_P2 0.4uMとアンチセンスプローブ1.6uMをEB_B_FIP_P2_Q2_55、EB_B_FIP_P2_Q2_60、EB_B_FIP_P2_Q2_65、EB_B_FIP_P2_Q2_70をそれぞれ使用して混合物を製造した。そして、IB−DFOをEB_B_RIP_P2で0.4uM代替し、これに対するアンチセンスプローブであるEB_B_RIP_P2_Q_60を1.6uM混合し、IB−DFOであるEB_B_FIP_P2とEB_B_RIP_P2を0.4uMずつ、EB_B_FIP_P2_Q2_60とEB_B_RIP_P2_Q_60を1.6uM混合した。エボラウイルスのBundibugyo L segment(gb:FJ217161、521bp)を遺伝子合成を通じて作製して、1×10^5、1×10^4、1×10^3 copies/reaction濃度のプラスミドDNAを使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、65℃で60分間行い、1分単位でAB7500(Applied Biosystems、CA、USA)リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【0094】
図10乃至図13は、アンチセンスプローブ(Anti−sense probe)を温度別に設計し、IB−DFOと共に使用して、LAMP等温核酸増幅リアルタイム蛍光測定を行った結果であって、55℃で1×10^5〜1×10^3 copies/reactionまでの検出時間は、高濃度からそれぞれ13.4分、15.3分、18.4分として蛍光検出時間が観察された。60℃は、それぞれ20.3分、22.7分、24.6分に蛍光検出され、65℃は、それぞれ47.7分、49.7分に検出され、1×10^3は検出されなかった。70℃は、いずれも蛍光検出されなかった。蛍光量は、60℃アンチセンスプローブに比べて、55℃で約50%程度であったが、検出時間は約6〜7分早く示された。
【0095】
図14に示されたように、Rn vs Min(non−normalization)タイプの結果、55℃アンチセンスプローブのbackground Rnが、60℃アンチセンスプローブに比べて2倍高く示された。このように、アンチセンスプローブの設計温度に応じてbackground Rn及びdelta Rnを調節することができる。
【0096】
図15乃至図17は、IB−DFOをFIP、またはRIP、またはFIP及びRIPをそれぞれ使用し、これに対する60℃アンチセンスプローブを含んで反応させた場合であり、FIPとRIPをそれぞれ代替した場合、蛍光量は類似に示されたが、RIPのIB−DFOがFIPのIB−DFOに比べて約10分早く示された。
【0097】
[配列リスト]
配列番号1:EB_B_F3
5’−GTGTGTTCAAGTACAGCATT−3’
配列番号2:EB_B_R3
5’−ATAAGGGAGGATGATCAAGG−3’
配列番号3:EB_B_FIP
5’−ACCTGGTGTTAGATGTTTATCTGAGGCCAAACATTATTTTGATAGCC−3’
配列番号4:EB_B_RIP
5’−TACATTAAGAGGAACCAATTTCCGCTGATAGAATTCCCACAATAAGTCTT−3’
配列番号5:EB_B_FIP_P2
5’−ACCTGG(internal dT−FAM)GTTAGATGTTTATCTGAGGCCAAACATTATTT(internal dT−BHQ1)GATAGCC−3’
配列番号6:EB_B_FIP_P2.5
5’−ACCTGGTGT(internal dT−FAM)AGATGTTTATCTGAGGCCAAACAT(internal dT−BHQ1)ATTTTGATAGCC−3’
配列番号7:EB_B_FIP_P3
5’−ACCTGGTGTTAGA(internal dT−FAM)GTTTATCTGAGGCCAAACAT(internal dT−BHQ1)ATTTTGATAGCC−3’
配列番号8:EB_B_RIP_P2
5’−TACA(internal dT−FAM)TAAGAGGAACCAATTTCCGCTGATAGAAT(internal dT−BHQ1)CCCACAATAAGTCTT−3’
配列番号9:EB_R_F3
5’−GCCTCACAATGTTAATCTTAGC−3’
配列番号10:EB_R_R3
5’−GATTGTCTCCCATGACCG−3’
配列番号11:EB_R_FIP
5’−CCTCTATGCCTCCTAAGTGCCAATCGAGAATATCCTCCTGAA−3’
配列番号12:EB_R_RIP
5’−GATTACAACAAAAACTGTGGACGAGCTGATCGTAACTTAAAACCAGT−3’
配列番号13:Res_LP
5’−GGTACGAACTCGGGC−3’
配列番号14:Res_RLP
5’−TGTGCACAAATCTCCTTAGT−3’
配列番号15:EB_R_FIP_P2
5’−CCTC(internal dT−FAM)ATGCCTCCTAAGTGCCAATCGAGAATATCC(internal dT−BHQ1)CCTGAA−3’
配列番号16:EB_R_RIP_P2
5’−GAT(internal dT−FAM)ACAACAAAAACTGTGGACGAGCTGATCGTAAC(internal dT−BHQ1)TAAAACCAGT−3’
配列番号17:EB_B_LP_F
5’−ATTACACTATACCATGACCCTT−3’
配列番号18:EB_B_LP_R
5’−CACTGCCTATGATTAAAGACT−3’
配列番号19:EB_B_FIP_P2−Q2_55
5’−CCTCAGATAAACATCTAAC−BHQ1−3’
配列番号20:EB_B_FIP_P2−Q2_60
5’−GGCCTCAGATAAACATCTAAC−BHQ1−3’
配列番号21:EB_B_FIP_P2−Q2_65
5’−TGTTTGGCCTCAGATAAACATCTAAC−BHQ1−3’
配列番号22:EB_B_FIP_P2−Q2_70
5’−GGCTATCAAAATAATGTTTGGCCTCAGATAAACATCTAAC−BHQ1−3’
配列番号23:EB_B_RIP_P2−Q_60
5’−CGGAAATTGGTTCCTCTTA−BHQ1−3’
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【国際調査報告】